FasLmRNA在椎间盘细胞中表达的分布

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1、FasLmRNA在椎间盘细胞中表达的分布作者：司春祥陈伯华吕振华【摘要】　　目的观察凋亡相关基因FasLmRNA在椎间盘细胞中表达的分布。方法收集胎儿及成人病理腰椎间盘髓核标本，PHAP激活单个核细胞诱导FasL表达，提取总RNA，RTPCR制备FasL基因片段。定向克隆入质粒载体pSPT19多克隆位点构建重组质粒，体外转录制备DigFasLcRNA探针。cRNA探针原位杂交进行FasLmRNA表达分布的观察。结果克隆化FasL序列经DNA测序准确无误，体外转录cRNA探针标记效果满意；胎儿腰椎间盘组织脊索细胞、软骨样细胞中可检测到FasLmRNA的较高杂交信号，成人突出椎

2、间盘细胞中罕见正常细胞，未检出FasLmRNA信号。结论FasL基因在胎儿期腰椎间盘细胞内表达，细胞凋亡发生早。成年时期，细胞数急剧减少，代谢功能低下，无法检出凋亡基因表达。【关键词】基因FasLRNA互补椎间盘原位杂交　　［ABSTRACT］ObjectiveToobservethedistributionofFasLmRNAinintervertebraldisc.MethodsNucleusgelatinosusspecimenswerecollectedfromfetusandpathologicdisc.PBMCwastreatedbyPHAP,andtotalRNA

3、extractedfromtheactivedPBMC.AfragmentofFasLgenewasreverselytranscriptedandamplifiedfromtotalRNAusingonestepRTPCR.PCRproductwastheninsertedintotheMCSofpSPT19.Afterverificationof11DNAsequencing,therecombinantplasmidpSPT19waslinearizedtosynthesizethedigcRNAprobeinvitro.ThedistributionofFasLmR

4、NAwasobservedonlumbarintervertebraldiscspecimensusinginsituhybridization.ResultsTheinsertedFasLcDNAfragmentinpSPT19FasLwasidentifiedbyDNAsequencing.ThelabelefficiencyofcRNAprobewassatisfied;TheFasLmRNAsignalswereemergedinbothnotochordcellsandchondrocytelikecellsinthenucleusoffetaldiscs.Conc

5、lusionTheFasLmRNAwasdetectedinthefetallumbarintervertebraldisccells,andapoptosisoccurredearly.Inadult,thequantityofintervertebraldisccellsreduced,themetabolismofthemdecreased,andtheexpressionofFasLmRNAcouldnotbedetected.　　［KEYWORDS］Gene,FasL;RNA,complementary;Intervertebraldisc;Insituhybridiz

6、ation　　FasL基因是目前已知的最重要的凋亡调控基因之一，属于肿瘤坏死因子家族成员的凋亡促进因子，是Fas的配体。体内外多种因素可以诱发FasL的表达，通过Fas的介导而产生一系列生化反应，最终导致细胞的凋亡。研究证实，椎间盘组织的间盘细胞上有FasL表达，FasL相关的细胞凋亡与腰椎间盘退行性变的发生有关[12]。但其mRNA表达的研究未见报道。本研究通过克隆FasL11cDNA片段制备地高辛标记的FasLcRNA探针，利用原位杂交方法对椎间盘中FasLmRNA的分布进行观察。　　1材料与方法　　1.1主要试剂及仪器设备　　PHAP、DEPC购自Sigma公司，APE

7、S购自上海生物工程公司。pSPT19质粒载体、大肠杆菌JM109、EasyHyb、分子克隆所用试剂盒、工具酶及所用仪器设备由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供。　　1.2标本来源　　　　收集胎龄＞5月的胎儿及手术取出的椎间盘髓核标本10例，置无菌EP管中液氮速冻后-70℃保存。10例病人中,男6例,女4例;年龄32～65岁,中位年龄50岁;病程6月～5年，平均1.4年。L4,5者5例，L5S1者4例。　　1.3引物设计　　引物依FasLmRNA序列（NM_000639.1）设计