细菌总蛋白的提取方法.doc

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1、细菌总蛋白和膜蛋白提取方法一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）1、自配裂解液（pH8.5-9.0）：50mMTris-HCl，2mMEDTA,100mMNaCl，0.5%TritonX-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100μg/ml溶菌酶，1μl/ml的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml裂解液/1g湿菌体。2、将40ml菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。4、1

2、000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1%SDS溶液透析后冻存。缺点：Westernblotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTrizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTrizol加入1.5m

3、l异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。4、用含有0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1mlTrizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。6、替代方案：将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1%SDS溶液中透析3次，1000g离心10min

4、去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白（TritonX-114去污剂法）1、配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1%TritonX-114，150mMNaCl,10mMTris-HCl，1mMEDTA，调pH值至8.0备用。2、菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体；用1ml含有5mMMgCl2的PBS洗涤3次，最后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。3、菌体沉淀加入1ml冷提取液，于4℃条件下放置2h，17000g离心10min，去除沉淀取上清。4、将上述上清中的TritonX-114含量增加到2%，再加入20

5、mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。5、将液相和去污相分开，分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45min。6、于4℃条件下17000g离心30min，用去离子水洗涤沉淀3次。7、将沉淀溶解在1%SDS溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验。8、SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。