植物总蛋白提取.doc

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1、一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）：1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质花粉在liquidnitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-20度2个小时(必要时过夜)，4度25000g离心20min后去上清，用含1%DTT的acetone溶液悬浮沉淀，-20度1个小时,再次离心去上清，将真空干燥的沉淀在等电聚焦缓冲液中(8Murea，20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10)20度震荡1小时，20度25000g离心20min，收集上清，沉淀再次用IEF缓冲液

2、离心收集上清，可为后续试验做准备。2．苯酚（phenol）提取法花粉在liquidnitrogen中研磨成粉末，添加1ml的phenol（tris8.8缓冲液）继续研磨5min,加提取缓冲液（0.1mol/L8.8Tris–HCl，5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose）。将样本转移至离心管中，4度震荡30min，25000g离心10min，将上层的phenol层转移进另一个试管，将下边的水相层加1ml的phenol（tris8.8缓冲液）及提取缓冲液，震荡，离心，将再次收集到的phenol与前边收集的混合，加5倍体积的0.1Mammoni

3、umacetatein100%methanol，在-20度震荡沉淀蛋白质，必要时过夜，4度  25000g离心10min，将沉淀用0.1Mammoniumacetatein100%methanol及80%acetone各洗两次,含10mmDTT的80%acetone再洗一次，在每一步中蛋白沉淀都要完全重悬—-20度震荡30min，4度  25000g离心20min，洗剂完成后，沉淀真空干燥，IEFbuffer提取蛋白质，如方法1。3．直接IEFbuffer提取蛋白质直接IEFbuffer提取蛋白质，花粉在liquidnitrogen中研磨成粉末，然后加入

4、IEFbuffer(8M尿素，20mmDTT,4%CHAPS，5mmEDTA，5mmTrisbase,2%ampholyte,PH:3-10).如方法1。4．Tris-HCL缓冲液法花粉在liquidnitrogen中研磨成粉末，加入Tris-HCL缓冲液（50mm,8.8,Tris-HCL,5mmEDTA,20mmDTT,100mmKCL,2mmPMSF）,在融化后，混合液在4度放30min,25000g离心20min,收集上清，对沉淀重新提取一次，将收集到的上清混合，用5倍体积的100%丙酮沉淀蛋白质，-20度孵育2h,离心后，用80%的丙酮洗剂沉淀

5、2次，IEFbuffer重悬沉淀，方法如1  5．利用Bradford试剂法估测提取的总蛋白浓度，并调整浓度行蛋白电泳，-80度保存。本人翻译的，具体方法流程见附件原文。·