实验七、植物蛋白的提取.doc

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1、实验七、植物蛋白的提取一、实验目的熟悉植物蛋白提取原理和方法，了解其意义及其应用价值。二、实验原理植物蛋白提取一般遵循如下基本原则：尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；减少对蛋白质的人为修饰；破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据该原则，植物蛋白制备过程中一般需要有四种试剂①离液剂：尿素和硫脲等；②表面活性剂：SDS、胆酸钠、CHAPS等；③还原剂：DTT、DTE、TBP、Tris-base等；④蛋白酶抑制剂及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物等，如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子，可在

2、其中加入0.1-5mmol/LEDTA，同时使金属蛋白酶失活。三、仪器和试剂仪器：离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱、分光光度计；三角瓶；试管；试管架；移液管；记时器；水浴锅试剂：1.20mL样品提取缓冲液：2.5mL0.5mol/LTris-HCl3.-20℃下预冷丙酮4.（1）标准蛋白质溶液：用0.9%NaCl溶解标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）粉末配制成10mg/ml的标准蛋白溶液。（2）双缩脲试剂：称取1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液

3、，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中或内壁涂以石蜡的瓶中。此试剂可长期保存，若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。四、实验步骤（改良丙酮沉淀法提取叶蛋白）1、蛋白提取取0.3g左右的植物叶片，加入4mL提取缓冲液和适量石英砂，色素多的可按材料鲜重的10%加入PVP，在研钵中研磨充分后转入10mL离心管中，摇匀并放在4℃条件下提取0.5h，充分溶解蛋白。4℃6000r/min离心10min，弃沉淀，上清液中加入2.5～3倍体积的预冷丙酮-20℃条件下放置10min，让蛋白充分沉淀。之后，4℃6000r/min离心5min，弃上清，使丙酮完全挥发后加入上样缓冲液50

4、0μl溶解沉淀，沉淀充分溶解后，转移至1.5mL离心管中，4℃10000r/min离心5min，取上清液即为所提取的蛋白溶液。2、蛋白定量（双缩脲法）（1）标准曲线的绘制取6支试管分两组，分别加入0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，0毫升的标准蛋白质溶液，用0.9%NaCl补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制出标准曲线。编号试剂（ml）123456蛋白质标准液0.10.30.50.70

5、.9—0.9%NaCl溶液0.90.70.50.30.11.0双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.0蛋白质浓度（mg/ml）135790吸光度（A）（2）样品测定取提取的蛋白质溶液0.1ml，加0.9%NaCl溶液0.9ml，双缩脲试剂4.0ml，混匀，于37℃水浴中放置20min，在540nm波长下进行比色。以标准曲线第6管（空白）调零点，测其吸光度（A）。根据吸光度值查标准曲线，即可求出样品中蛋白质的浓度。（注意样品浓度不要超过10mg/ml）五、结果计算从标准曲线上查得蛋白质含量（mg）×100样品体积（ml）样品蛋白质（%）=