重组绿豆胰蛋白酶抑制剂片段对肠癌细胞sw480迁移的影响-论文.pdf

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1、山西大学学报(自然科学版)35(1)：126～129，2012JournalofShanxiUniversity(Nat．Sci．Ed．)文章编号：0253-2395(2012)01—0126—04重组绿豆胰蛋白酶抑制剂片段对肠癌细胞SW480迁移的影响赵亚蕊1，李宗伟1，赵超1，付荣1，王兴华2，李卓玉¨(1．山西大学生物技术研究所．化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原030006；2．山西大学生命科学学院，山西太原030006)摘要：探讨重组胰蛋白酶抑制剂活性片段(LysGP33)的抗肠癌效应．大肠杆菌原核表达LysGP33活性片段，GST索和

2、层析柱对表达蛋白进行纯化．MTT比色和细胞划痕方法检测LysGP33活性片段对SW480细胞增殖和迁移的影响．结果表明：10／umol／LLysGP33活性片段对SW480细胞的增殖活性无明显影响，但能够有效地抑制SW480细胞的迁移，并呈现时间依赖效应．绿豆胰蛋白酶抑制荆抑制了肠癌细胞的迁移，在抗肿瘤漫润和转移中具有一定的应用前景．关键词：绿豆胰蛋白酶抑制荆l细胞增殖；细胞迁移中图分类号：Q814文献标识码：A肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，随着我国饮食结构的改变，其发病率呈逐年上升趋势[1]．在肠癌死亡的众多因素中。侵袭和转移是影响肠癌患者治疗和预后的重要因

3、素，目前，虽然放射治疗和手术治疗可有效地控制早期肿瘤，但是对于转移的肿瘤预后较差，因此，探寻一种有效的、非手术的、低毒的抑制肿瘤细胞侵袭和转移的抑制剂对肠癌的治疗和预后有重要意义．蛋白酶抑制剂具有广泛的生物学活性，在植物体内含量丰富，主要包含八种丝氨酸蛋白酶抑制剂家族和一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族[2]．其中丝氨酸蛋白酶抑制剂由于其抗癌活性备受研究者的关注．胰蛋白酶抑制剂属丝氨酸蛋白酶抑制，主要有Kunitz和Bowman-Birk两种类型，其中来源于大豆的Bowman-Birk型抑制剂对肠癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤等多种肿瘤表现出了明显的抗癌活性[3。5

4、1；豌豆Bowman—Birk型胰蛋白酶抑制剂可抑制结肠癌细胞的增殖[6]；荞麦胰蛋白酶抑制剂可通过诱导实体瘤细胞凋亡发挥抗癌作用[7]．胰蛋白酶抑制剂在抑制肿瘤细胞增殖，抗凋亡方面表现了良好的应用前景．绿豆胰蛋白酶抑制剂全长72个氨基酸，属Bowman-Birk类抑制剂，有Lys和Arg两个活性中心，分别具有抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性，目前对绿豆胰蛋白酶抑制剂在分离纯化和其生化活性方面的研究较多[8]，但对其生物学活性研究较少．本研究为探讨绿豆胰蛋白酶抑制剂Lys活性片段(LysGP33)的抗癌活性，原核表达了含有LysGP33的融合蛋白GST-Ly

5、sGP33，体外研究该活性片段对肠癌细胞增殖和迁移的影响，从而为制备研发与绿豆胰蛋白酶抑制剂相关的抗癌药物提供实验依据．1材料与方法1．1材料1．1．1菌株与质粒E．coliDH5a，本室保存．重组质粒pGEX一4T．1一LysGP33，由中科院上海生化所戚正武院士馈赠．1．1．2细胞系人结肠癌细胞系SW480。购于武汉博士德生物工程有限公司．收稿日期：2011一lo．21；修回日期：2011一ll一15基金项目：国家自然科学基金(31040018)；山西省留学基金(2010-2012)；山西省国际合作项目作者简介：赵亚蕊(1981一)．女．硕士研究生．"1

6、1-通讯联系人：李卓玉(1964一)，女，教授．博士生导师，主要从事细胞生物学面的研究．E-mail：lzy@SXU．edu．cn赵亚蕊等：重组绿豆胰蛋白酶抑制剂片段对肠癌细胞SW480迁移的影响1271．1．3试剂DMEM培养基为Thermo公司产品，GlutathioneSepharose4FastFlow购自GEHeahh-care公司；BApNA(苯甲酰一dl—Arg—P一硝基酰替苯胺盐酸盐)为上海三杰生物技术有限公司产品；胰蛋白酶为北方同正产品；MTT为北京索莱宝科技有限公司产品．1．2方法1．2．1重组绿豆胰蛋白酶抑制剂片段的表达纯化将含有绿豆L

7、ys活性片段(LysGP33)基因的重组质粒pGEX一4T一1一LysGP33转化到E．coliBL21(DE3)．取阳性克隆接种于100mL含Amp的LB液体培养基中，37℃摇床培养至A。。。约为0．5，加IPTG终浓度为0．5mmol／L进行诱导表达．37℃培养3h后，离心收集菌体。悬浮于PBS缓冲液中，冰上放置．用超声波破菌体，13000r／rain离心沉淀细胞碎片。收集上清．上清经过GST亲和层析柱纯化，样品反复通过亲和柱3次。以确保目的蛋白结合到柱材料上．用PBS缓冲液清洗杂蛋白，再用10mmol／L还原谷胱甘肽洗脱目的蛋白．纯化产物用15％SDS

8、-PAGE电泳检测．1．2．2重组绿豆蛋白酶抑制剂片