ifitm1对结肠癌sw480细胞增殖和黏附的影响论文

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1、IFITM1对结肠癌SW480细胞增殖和黏附的影响论文何敬东，张振书，肖冰，周高速，张以洋，耿焱，张亚历，智发朝.freelacelllineS:Toinvestigatetheeffectsofinterferoninducedtransmembraneprotein1(IFITM1)ontheproliferationandheterotypicadhesionofSETHODS:RebinantvectorsofpEGFPC3/IFITM1icroscopy(LCSM)inegreenfluorescenceprotein(GFPIFIT

2、M1)forthegeneexpressionpositionincellline.Theproliferationofcelllineembranes,suggestingcorrectexpressionofIFITM1genesaftertransfection.ThecellgrobersofIFITM1/S1caninhibittheproliferationandheterotypicadhesionofS1)对结肠癌细胞S1重组质粒，重组质粒转染结肠癌细胞株S1重组质粒的测序序列与IFITM序列完全一致，重组质粒转染S1/S1/S

3、1正确表达.细胞生长曲线显示转染后的IFITM1/S1/S1/S1可抑制S1）是调节IFN抗增殖、分化的重要蛋白，与细胞的黏附性、增殖及对IFN治疗的敏感性有关.IFN可诱导IFITM1在U937,Jurkat,K562等细胞中表达.我们在筛选大肠癌cDNA噬菌体表达文库时获得IFITM1基因，为了研究该基因在结肠癌中的作用，我们构建了pEGFPC3/IFITM1真核重组质粒并且转染到大肠癌细胞株S1对S购自Invitrogen公司；optiMENI，G418购自Gibco公司；RPMI1640细胞培养液、类标准胎牛血清购自兰州民海公司；IV型

4、胶原购自Sigma公司；pEGFPC3载体由瑞典卡罗琳斯卡大学张宏权教授惠赠.1.2方法大肠癌细胞株SI1640培养.构建IFITM1重组质粒：上游引物：5′GCAAGCTTATGCACAAGGAGGAACATGAG3′；下游引物：5′AGAGGATCCCTAGTAACCCCGTTTTTCCTG3′，用PfuDNA聚合酶扩增IFITM1，扩增条件为95℃3min,95℃30s,.freelin，33循环，72℃延伸5min.预计扩增产物长度为395bp.PCR产物纯化后经HindIII和BamHI酶切后亚克隆到pEGFPC3表达载体上.Hind

5、III和BamHI限制性内切酶酶切鉴定重组质粒，阳性重组质粒送上海博亚生物公司测序.对数生长期的SENI稀释Lipofectamine2000TM和IFITM1/pEGFPC3重组质粒，按照Lipofectamine2000TM脂质体转染试剂操作说明手册操作.G418400mg/L筛选获得亚克隆细胞株IFITM1/S1在细胞中的正确表达.实验同时设置转染pEGFPC3的S1/SI1640培养液培养，每日取3孔，用2.5g/L胰酶消化法进行活细胞计数，每孔计数3次，计算均值；以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线.IFITM1/SI16

6、40培养液（含5g/LBSA）稀释至1×108/L，加入已经用15mg/LIV型胶原、150μL/孔包被的96孔板内，每孔100μL，置于37℃，50mL/LCO2的孵箱中培养30，60min.用PBS液轻轻洗3遍，洗去未黏附的细胞.再用2.5g/L胰酶消化，收集细胞并计数.统计学处理:采用SPSS13.0软件对实验数据进行方差分析,数据以x±s表示.2结果pEGFPC3/IFITM1重组质粒经HindIII和BamHI限制性内切酶酶切，获得DNA插入片段与目的基因大小一致，表明目的基因已经插入到pEGFPC3的HindIII和BamHI多克隆

7、位点之间（Fig1），插入的DNA序列与IFITM1全长cDNA序列一致.G418筛选获得亚克隆细胞IFITM1/S1）呈现在细胞膜上，提示基因的正确表达.而转染空载体pEGFPC3的S1基因的S1/S1可抑制S1/S1/S1对S1在多种细胞如U937，Jurkat，K562，RSa表达，该基因的表达与细胞增殖、黏附及细胞对IFN的敏感性有关［1］.采用转基因技术是研究基因功能常见的方法［2］.我们构建pEGFPC3/IFITM1重组质粒并转染S1.通过激光共聚焦显微镜检查绿色荧光融合蛋白，可以明确目的基因的表达及其在细胞中位置，可以预测基因表

8、达的正确性［3］.IFITM1/S1具有抑制大肠癌细胞株S1是几种细胞膜蛋白的一个组成部分，这几个膜蛋白包括CD19，CD21，CD81，而CD81是