hif1α基因表达下调对人结肠癌sw480细胞增殖和vegf表达的影响论文

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1、HIF1α基因表达下调对人结肠癌SW480细胞增殖和VEGF表达的影响论文【摘要】目的:研究转录因子缺氧诱导因子1α（HIF1α）在缺氧条件下对人结肠癌STT法检测HIF1α被抑制后，S2000购自Invitrogen公司；兔抗HIF1α多克隆抗体、VEGF多克隆抗体购自SantaCruz公司，羊抗兔HRP二抗购于北京中杉金桥公司；逆转录试剂盒和T4DNA连接酶购自MBI公司；Tag聚合酶和TRIZOL试剂购自Gibco公司；蛋白酶抑制Cocktail购于Sigma公司；PVDF膜购自Millipore公司；ECL试剂盒购于Pierce公司；HIF1α靶shRNA和无义对照的D

2、NA寡核苷酸链和PCR引物由博士德公司合成；pSUPEREGFPsiRNA表达载体由第三军医大学陈春霖博士赠送.SI1640中培养（37℃，210mL/LO2，740mL/LN2，50mL/LCO2）；低氧条件建立：将生长状态良好的S2000脂质体介导下进行HIF1αshRNA表达载体和无义shRNA表达载体的转染，空白对照组孔内加入含相同浓度脂质体的RPMI1640培养液.6h后移去含脂质体的培养液，换为含100mL/L血清的RPMI1640培养液继续培养.48h恢复生长后，用含200g/LG418的培养液筛选6d，再用含G418400mg/L的培养液筛选3d，换含200g/LG41

3、8的培养液继续扩大培养，进行后续操作或冻存.1.2.4半定量RTPCR检测TRIZOL法提取各组细胞的总RNA并定量；各样本取1μg总RNA，按MBI公司试剂盒说明进行逆转录；取cDNA5μL/样本，常规PCR反应，GAPDH为内对照.PCR引物如下：HIF1α上游5′CTGACCCTGCACTCAATCAA3′，下游5′CTTTGCTTCTGTGTCTTCAGCAGCA3′（245bp）；VEGF上游5′ATGAACTTTCTGTCTTG3′，下游5′TGCATGGTGATGTTGGAC3′（382bp）；GAPDH上游5′ACCACAGTCCTGCATGCCATC

4、AC3′，下游5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′（450bp）.20g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，GeneGENIUS凝胶成像系统扫描条带灰度值并进行分析，每组检测5个样本，RTPCR产物比值=(HIF1α（VEGF）mRNA灰度值/内对照GAPDHmRNA灰度值)×100%.1.2.5TT试验将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔1×104个细胞，细胞贴壁后缺氧培养24h，分别加入MTT，于酶标免疫测定仪上测其A490值,具体方法见文献.分别设空白对照组、无义siRNA组、有义siRNA组，每组均设6个平行孔，并重复3次(批)实验.细胞存活率=（实验组A值/对照

5、组A值）×100%.统计学处理：A值用x±s表示,采用SPSS11.5统计分析软件对数据进行分析，不同组间比较采用单因素方差分析,P0.05表示有统计学意义.2结果2.1RNA干扰抑制STT检测结果显示，HIF1α有义siRNA组细胞A值（0.67±0.07）明显低于HIF1α无义siRNA组(1.05±0.04),空白对照组细胞A值最高（1.15±0.04）,HIF1α有义siRNA组与两对照组比较有明显差异.以空白组的细胞存活率为1，HIF1α有义siRNA组细胞存活率明显低于HIF1α无义siRNA组和空白对照组，说明在缺氧环境中，HIF1α对细胞增殖有调控作用.3讨论目

6、前HIF1α在细胞增殖和调亡中所起的作用仍存在争议.有研究报道HIF1α抑制凋亡，促进增殖，促进肿瘤发生［4］.HIF1α体内、体外转染均可促进肺癌A549细胞的生长，其机制与其能促进细胞恶性增殖和抑制凋亡有关［5］.而另一方面，也有报道证实HIF1α能稳定p53，从而促进细胞凋亡［6］.不同的研究结果提示HIF1α可能在不同的细胞系中分别发挥促进或抑制凋亡的作用.本研究结果表明HIF1αRNA干扰对SizukamiY,LiJ,ZhangX,etal.Hypoxiainduciblefactor1independentregulationofvascularendothe

7、lialgroakaediatesactivationofculturedvascularendothelialcellsbyinducingmultipleangiogenic［J］.CircRes,2003,93(7):664-673.［4］VaupelP.Theroleofhypoxiainducedfactorsintumorprogression［J］.Oncologist,2004,9(Suppl5):10