纳豆激酶固态发酵工艺参数的两种不同设计方法优化-论文.pdf

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1、FOODANDFERMENTAT10NINDUSTRIES纳豆激酶固态发酵工艺参数的两种不同设计方法优化田智斌，董超，史延茂，张聪莎，李君华1(河北工业大学化工学院生物工程系，天津，300100)2(河北省生物研究所细胞与生化研究室，河北石家庄，050081)摘要采用响应面法和人工神经网络耦合遗传算法，对影响固态发酵产纳豆激酶的工艺参数进行了优化，并对这两种方法的优化效果进行评价。结果表明：在纳豆激酶固态发酵工艺参数优化中，采用人工神经网络耦合遗传算法较响应面法具有更好的数据拟合能力和预测准确度，纳豆激酶固态发酵工艺最佳参数：接种量4％，初始含水量55％，大豆装量90g／250

2、mL，发酵温度36．09~C，蔗糖添加量1．5％，MgSO4·7H2O添加量0．21％，CaC1，添加量0．27％，发酵时间24h。在该条件下发酵产物的最大酶活可达7631．284-219．54U／g，较单因素试验的最高水平提高了29．O2％。关键词纳豆激酶，固态发酵，响应面法，人工神经网络，遗传算法纳豆激酶(nattokinase，NK)是纳豆芽孢杆菌(Ba．larbio；注射用尿激酶(10O00U／支)，北京赛生药业有cillusnatto)在发酵过程中产生的次级代谢产物，是一限公司；琼脂糖，北京奥博星生物技术有限公司；其他种具有纤维蛋白溶解活性的碱性丝氨酸蛋白酶⋯。试剂均

3、为国产分析纯。相比链激酶、尿激酶等已广泛用于临床的溶栓制剂，1．1．2培养基NK具有安全高效、出血倾向小、体内半衰期长、可口斜面培养基(％)：蛋白胨1，牛肉浸膏0．5，NaC1服、成本低廉等特点，有望开发成为一种新型的溶栓0．5，琼脂1．2，pH7．2—7．5。药物或保健食品。固态发酵的纳豆通过真空冷种子培养基(％)：蛋白胨1，牛肉浸膏0．5，NaC1冻干燥工艺制成纳豆冻干粉，可直接作为一种食源性0．5，pH7．2～7．5。溶栓制品，无需下游分离提取等繁杂工序。在同等生固态发酵原始培养基(％)：大豆装量90g／250产成本的情况下采用固态发酵生产NK比液态发酵mL，蔗糖1．5，

4、MgSO4·7H2O0．1，CaC10．2，自然pH。具有更高的产率。1．1．3主要仪器本文在单因素试验的基础上，通过Plackett．Bur—PW／IO一002型台式保温培养箱，重庆实验设备man试验设计筛选影响产NK的主效应参数和最陡厂；VS一1300U型超净工作台，苏州净化设备有限公爬坡试验设计确定最佳产酶响应区域，采用响应面司；SKY一2012C恒温摇床，常州诺基仪器有限公司；设计和人工神经网络耦合遗传算法优化了NK固WJ一2型恒温恒湿培养箱，上海沪粤明科学仪器有限态发酵工艺参数，同时比较了这两种方法的优化效公司。果1．2实验方法1．2．1菌种活化l材料与方法将4℃保存

5、的纳豆芽孢杆菌菌株转接至试管斜1．1材料与仪器面培养基，33℃恒温培养24h备用。1．1．1菌种与试剂1．2．2种子液培养纳豆芽孢杆菌，河北省科学院生物研究所保存菌挑取斜面种子1环转接入装有50mL液体培养株；牛纤维蛋白原，Sigma；凝血酶(1000U／支)，So一基的250mL三角瓶，33~C、200r／min，摇床恒温培养14～15h，取样镜检，无其他杂菌污染即可用于固态第一作者：硕士研究生(董超高级工程师和史延茂研究员为通发酵。讯作者，E-mail：dongchao8605@sina．com)。{河北省科技攻关计划(11275508D)1．2．3三角瓶固态发酵培养收稿日

6、期：2012—09—23，改回日期：2012—10—22按照试验设计方案配制不同组分比例的固态发酵培养基，分装入250mL三角瓶中，封口，灭菌。在134l!：：(!!旦!2无菌操作条件下，按试验方案向各三角瓶中接人不同表2最陡爬坡试验设计Table2Thesteepestascentexperimentdesign比例的纳豆菌种子液，封口并摇匀，置于已消毒的恒温恒湿培养箱进行固态发酵培养，不同时间段取样并测定NK酶活。1．2，4NK酶活的测定及定义采用改进的琼脂糖一纤维蛋白平板法测定。。NK酶活单位定义为：在37oC，1min内分解1nmol溶解于0．1mol／L(pH7．4)

7、H，PO缓冲液中的1．3．3响应面法试验设计“H．D—Va1．Leu．Lys-pNA(浓度为5X10mol／L)的NK为了确定NK固态发酵工艺参数的最优水平，本量为1U。次试验选用响应面中心组合试验设计，主效应参数和1．3试验设计1．3．1Plackett．Burman试验设计筛选影响产各参数水平如表3所示。表3中心组合试验设计参数水平编码表NK的主效应参数Table3Parametersandlevelsofcentralcompositedesign通过单因素预试验确定了影响固态发酵产N