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1、CIK细胞不同培养时间的生物学活性CTK细胞不同培养时间的生物学活性［摘耍］目的探讨CTK细胞培养时间与细胞毒活性的关系。方法抽取恶性肿瘤患者的外周血分离单个核细胞(PBMC),用细胞因子诱导培养CTK细胞，于培养第0、7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CTK细胞。用流式细胞仪分析检测CTK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率及增值率，用MTT法测定其对肺癌细胞株A549杀伤活性。结果培养第21天细胞扩增倍数为(372±1.87)倍，培养第28天细胞扩增倍数为(410±6.52)倍，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)；培养第35天CI
2、K细胞扩增倍数为(414±5・16)倍，与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义(P??0.05)o培养至第28天CTK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率为(35・6±2・30)%,达最高峰，其后逐渐降低。用MTT法检验不同培养时间的CTK细胞对肺癌细胞株A549的杀伤活性，当效靶比为10:1时，培养21d的CTK细胞杀瘤率是95%,达最高峰；当效靶比20：1时培养21d的CIK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比40:1时培养14d的CTK细胞杀瘤率即可达到100%o结论培养时间的延长有利于增强CTK细胞的细胞毒活性，CTK细胞的最佳培养时间应为2
3、8d左右。增加效应细胞的数量，会大大提升对肿瘤细胞的杀伤力。［关键词］CTK细胞；细胞毒活性；增殖率；表型［中图分类号］R-331［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2013)01(a)-0012-03肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段LI益受到重视［1］。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedki11ercel1,CTK)是肿瘤生物免疫治疗的主力军［2］。其主耍的效应细胞为CD3+、CD56+表型T淋巴细胞，因此，培养高纯度CD3+、CD56+细胞是提高CTK细胞毒活性，增强对肿瘤细胞杀伤的关键［3］。本研究通过体外的CTK细胞
4、毒实验及流式细胞仪分析检测CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率，观察不同培养时间CIK细胞的增殖能力、杀伤活性，以探讨CIK细胞培养时间与细胞毒活性的关系。1资料与方法1・1主要试剂人淋巴细胞分离液FicollPaquePlus,基因重组人IL-2、IL-1>IFN-Y和CD3单抗(Sigma公司)，RPMI1640培养基(美国GIBC0),小牛血清(NCS)(美国GIBCO),四甲基偶氮呼盐MTT(华美公司)，二甲基亚飒(DMSO)(Sigma公司,美国)。流式试剂CD3FITC/CD56PE(BD公司，美国)，肺癌细胞株A549均为本实验室保存和传代培养。
5、1.2实验方法1.2.1CIK细胞的培养抽取恶性肿瘤患者的外周血,Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞(PBMC),用RPMI1640调整至2X106个/mL进行培养，培养基中含10%小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、1X105U/L青霉素、100mg/L链霉素和50umol/L.铳基乙醇、IFN-y1000U/mL,于当日加入IFN-y(1000u/mL),置于37°C和体积分数为5%的C02培养箱中培养24h,第1天加入IL-2(1000U/mL)、IL-1a(100u/mL)、McAb(50ug/mL),以后每3天换液1次，培养42d,于培养第0、7、1
6、4、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞。1.2.2CIK细胞扩增分析在培养扩增后第7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞制成细胞悬液，用台盼蓝排除法计数活细胞，并除以初始细胞数，求出实际扩增倍数。1.2.3CIK细胞的表型分析分别收取培养第0、7、14、21、28、35、42天CIK细胞，用PBS洗2遍，重悬后分别加入1.5mL管中，每管106个细胞，离心后，加FITC标记的抗CD3mAb和PE标记的抗CD56mAb各50uL,于4°C孵育30min。PBS洗2遍，离心后,每管加1niLFACS保存液。用流式细胞仪分析CIK细胞
7、的表型。1.2.4CIK细胞体外细胞毒活性检测釆用96孔培养板用MTT法测定CIK细胞的杀伤活性，收取第0、7、14、21、28、35、42天培养的CIK作为效应细胞，肺癌细胞株A549细胞作为靶细胞，取对数生长期A549细胞调整浓度为1X105个/niL,CIK细胞浓度分别调整为1X106/mL>2X106/mL^4X106个/mL,效靶比依次为10：1、20：1、40:1,分为实验组、效应细胞组、靶细胞组，每组3个复孔，实验组每孔加效应细胞、靶细胞各100PL,靶细胞组每孔加入靶细胞、1640培养液各100uL,效应细胞组每孔加入效应细胞、1640培养液各1
8、00uL,置37°C,5
