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1、食用菌学报2010.17(1):6～9文章编号:100529873(2010)0120006204高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响3任艳,黄玉杰,张新建,杨合同(山东省科学院生物研究所,山东省应用微生物重点实验室,山东济南250014)摘要:采用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens,EHA105菌株)介导法,对平菇(Pleurotusostreatus)菌丝体遗传转化的最佳试验条件进行研究,结果表明:当平菇菌丝体与甘露醇和山梨醇的混合液预处理20min,且与农杆菌共培养60min时,转化效率
2、高且用时较少。经PCR和SouthernBlotting检测表明,转移DNA(transferredDNA,T2DNA)中的潮霉素抗性基因hph已整合到转化子基因组中。关键词:平菇;根癌农杆菌;hph基因;高渗;共培养平菇(Pleurotusostreatus)作为一种食用真1材料和方法菌,在我国得到广泛栽培,但是由于平菇品种长期无性繁殖致使菌种退化、产量降低,而传统的1.1供试菌株与质粒育种技术存在着周期长、见效慢、不稳定等问平菇(Pleurotusostreatus)菌株LZ-2由山题,因此迫切需要探索更高效、稳定的育种方
3、东省农业科学院万鲁长老师赠送;根癌农杆菌法。基因工程技术的发展为菌种选育开辟了一(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105菌株由条新途径,1998年,DEGROOT等首先把农杆中国农业大学张力群老师惠赠;含有潮霉素抗性菌介导法应用于真菌的遗传转化,以真菌的分基因hph的质粒pCAMBIA1302由山东省应用生孢子和菌丝为受体,成功地将T2DNA转入泡微生物重点实验室保存。盛曲霉(Aspergillusawamori)、哈茨木霉1.2培养基(Trichodermaharziamum)、粗糙脉胞菌PDA培养基
4、(/L):马铃薯200g,葡萄糖(Neurosporacrassa)和双孢菇(Agaricus15g,琼脂15g。[1]bisporus)中;CHEN等利用改进的农杆菌介PDA选择培养基(/L):PDA培养基中加入[2]导法对双孢菇子实体进行转化并获得成功;不同浓度的潮霉素(Sigma公司)。2001年,THOMAS等同样用农杆菌转化了双LB液体培养基(/L):胰蛋白胨10g,NaCl孢菇的菌丝体和担孢子萌发菌丝,获得了稳定10g,酵母提取物5g,pH7.0～7.5。[3]的转化子;但上述方法中转化效率相对较低,LB固体培养基
5、(/L):LB液体培养基中加入获得的转化子大部分不稳定。在传统的基因枪15g琼脂。遗传转化方法中,许多植物及外植体在轰击转LB诱导培养基(/L):LB液体培养基中加入[427]化前经渗透处理都有助于提高转化效率,因乙酰丁香酮(AS,溶于二甲基亚砜中,工作浓度为此,山东省应用微生物重点实验室通过对平菇200μmol/L)。菌丝体进行高渗处理以及与农杆菌共培养时间共培养诱导培养基(/L):葡萄糖5g;K2等条件的探索,筛选出平菇菌丝体转化的最佳HPO40.5g;MgSO4·7H2O0.2g;CaCl20.2g;条件。谷氨酸0.05
6、g;NaCl0.02g;EDTA铁钠盐收稿日期:2010202205原稿;2010202228修改稿基金项目:山东省科技发展计划项目(编号:2008GG10002025)、国家高技术研究发展计划(863计划)(编号:2006AA10A211)的部分研究内容作者简介:任艳(1973-),女,1999年毕业于山东大学临床医疗专业,学士学位,助理研究员,主要从事微生物遗传改造及应用研究,发表主笔论文5篇。3本文通讯作者E2mail:yanght@keylab.net第1期任艳,等:高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响70.0
7、66g;Na2MoO40.002g;琼脂20g;pH7.21.4.5转化子的稳定性检测～7.4。使用前加入溶于二甲基亚砜的AS,工作转化子在普通PDA平板上连续转接15代浓度为200μmol/L。后再接入到PDA选择培养基平板上,观察菌丝1.3潮霉素适宜筛选浓度的确定生长状况,与普通PDA平板上菌丝生长一致的将平菇菌株在PDA平板上25℃培养5d进是可稳定遗传的转化子。行活化,然后分别接种于含有50、60、70、80、90、1.4.6转化子的分子检测100、200μg/mL潮霉素的PDA平板,以不含潮霉1.4.6.1PCR鉴定
8、素的PDA平板为对照,置于28℃恒温培养箱培按文献[9,10]的方法提取3个抗性稳定养,每天观察菌丝生长情况,以筛选PDA中添加潮的转化子总DNA,以其为模板,以HPH2F:5’霉素的适宜浓度。CCGGTTTCCACTATCGGCGA3’HPH2R:5’1.4根癌农杆菌介导的
