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《乙型肝炎病毒DNA克隆的菌落原位杂交.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、遗传HEREDITAS(Beijing)‘(2);35-371984实验技术与乙型肝炎病毒DNA克隆的菌落原位杂交方法苏国富徐永强刘传暄王嘉玺马清钩（军事医学科学院基础医学研究所，北京）在遗传工程的DNA重组试验中，需从大1.pAol-HBV质粒DNA的制备将含量的转化子中筛选含特殊DNA序列的克隆，有pAo,HBV重组质粒的菌株置37℃培养，离尤其是当被克隆的基因中无选择标记时，应用J乙收集菌体，然后参照Zasloffl'，报道的酸酚方菌落原位杂交进行筛选是最理想的。其主要法、Strongin等［I71，的制备电泳方法，以及氯化艳
2、优点是特异性强，因此它成为DNA体外重组密度梯度超速离心法［Ial，获得纯的pAoiHBV质实验的重要方法之一。为了便于使Grunstein粒DNA,等〔习的菌落原位杂交法在我国推广应用，我们2.琼脂糖凝胶电泳采用垂直板电泳装对Grunstein等的方法作了适当修改，并对影置。电泳缓冲液为：400mMTris-HAc(pH8.0),响实验结果的几个主要因素作了初步比较。采5mMNaAc,1mMEDTA,琼脂糖浓度为用本修改方法筛选含乙型肝炎病毒DNA的克0.7多。50伏电泳6-8小时。隆的结果表明，此法是特异而可靠的。3.EcoRI
3、酶解条件1FcgpAo,-HBV质粒DNA对1单位EcoRI。反应缓冲液为：100材料和方法mMTris-HCI(pH7.5),10mMMgCl,,,370C材料反应1小时。含pA,l-HBV重组质粒的菌株由本室马贤4.HBVDNA的制备用EcoRI分别凯教授馈赠。该质粒已重组人全长乙型肝炎病酶解经氯化艳密度梯度超离心法、酸酚法和制毒(HBV)DNA(3,200bp)，限制性内切酶EcoRI备电泳法分离纯化的质粒pAolHBVDNA，经能将HBVDNA从该质粒上切离。制备电泳后，置凝胶于含1/e9ml嗅化乙锭的Nala5I（北京原子
4、能研究所），TIC1,（中国电泳缓冲液内5分钟，在紫外灯下切取含HBV科学院微生物所赠），[a-"PIdATP(Amer-DNA的凝胶带，然后用电泳洗脱法[7]从含HBVsham)，牛血清白蛋白（SeravacLaboratories),胸DNA的凝胶中回收DNA片段。用同位素标昔三磷酸（TTP)、脱氧鸟昔三磷酸（dGTP)、记的DNA试验证明DNA从凝胶上的回收率脱氧胞昔三磷酸(dCTP)（均为Boehriger产为75-80外。品），脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)(Sigma)，大肠5.Na'a5I标记HBVDNA在200Iz
5、1反杆菌多聚酶I(BRL),葡聚糖G-50(Pharma-应体积内，含2.5X10-'MKI,0.5-1mCicia),硝酸纤维素滤膜（Milliporecorporation和Na1a5I,10Fcg经热变性处理的HBVDNA,0.1上海第十制药厂），小牛胸腺DNA（上海牛奶MNaAc-0.04MHAc(pH5.0),3.25mMTIC13o公司），聚蔗糖(Pharmacia)I聚乙烯毗咯烷酮其余基本上参照Commerford等[1,3，已报道的方(FlukaAG.),EcoRI（由本实验室制备）。SuGuofuetat.!Col
6、onyHybridizationinsitufor方法ScreeningforClonesContainingHBVDNA35法进行。用本标记方法放射性比强可达5XpA,,-HBV的菌株和大肠杆菌C600以及含106/pgDNA.pBR325的菌株作试验材料，分别用经Nalz51和6．缺口翻译法（NickTranslation）标记DNA[a-2p1dATP标记的HBVDNA作探针，按“材根据Rigby等66'N1报道的方法，预先将料和方法。所述进行菌落原位杂交，结果见图to[a"P]dATP(250,uCi)经真空干燥，然后分别加
7、人50mMTris-HCI(pH7.9),5mMMgCl,,10mm疏基乙醇，5peg牛血清白蛋白，dGTP,dCTP,TTP各20pM,IpgHBVDNA。待加人100uug脱氧核糖核酸酶I后，置反应液于28℃水浴1分钟，再加人10单位大肠杆菌DNA多聚酶1,14℃温育3小时，然后在100间反应总体积中加人60川0.25MEDTA(pHab8.0)终止反应。经葡聚糖G-50脱盐收集-12p-图1菌落原位杂交图谱图上方的4个黑点为含pAot-HBV的菌株，其余的HBVDNA。放射性比强为2X10$加gDNA.浅色斑点为大肠杆菌C60
8、0或含载体pBR325的菌7，菌落原位杂交基本参照Grunstein株。(a)Na"'I标记的HBVDNA探针；(b)〔。－"P]dATP标记的HBVDNA探针，等〔叼的方法，作了某些修改。具体操作步骤如下：将硝酸纤维素滤膜经15磅高
