【精品】第二章微生物的纯培养和显微技术.doc

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1、第二章微生物的纯培养和显微技术计划学时：2重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用屮,不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群屮分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被加他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptictechnique),它是保证微生物学研究正常进行的关键。试管、玻璃烧瓶、平川I.(culturedish

2、,Petridish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质称为培养基可以加到器川L屮示一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具屮。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基木保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器川I•也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气屮的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞了塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、教料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气屮的其他微生物不能通过。而平川I

3、•是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气屮微生物的污染2.接种操作用接种环或接种针分离微生物,或在无菌条件下把微生物由一个培养器川L转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究屮最常用的基木操作。由于打开器川1就可能引起器JIIL内部被环境屮的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作(图2-1),或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作(图2-2)。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。用以挑取和转接微生

4、物材料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的磔倂合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而移植液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。二、用固体培养基分离纯培养单个微生物在适宜的尚体培养基表面或内部生长、繁殖到一定稈度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的了细胞生长群体，称为菌落(colony)o当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔(lawn)o不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般部具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据(图27)o大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在尚体培养基上形

5、成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板(cultureplate)的简称，它是指

6、司体培养基倒入无菌平川L,冷却凝固后，盛固体培养基的平川L。这方法包括将单个微生物分离和I古I定在固体培养基表Lfli或里面o网体培养基用琼脂或其它凝胶物质尚化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是齐种菌种分离的最常用手段。].稀释倒平板法(pourpl

7、atemethod)先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释(如1:10、1:100.1:1,000.1:10,000),然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50°C左右的琼脂培养基混合，摇匀示，倾入灭过菌的培养皿屮，待琼脂凝尚后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可岀现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基屮就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随示挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。2.涂布平板法(spreadplatemethod)由于将含菌材料先加到还较烫的培养基屮

8、再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被同定在琼脂屮间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究屮更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固示，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落(图2-4)。3.平板划线法(streakplatemethod)用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线(图2-5),微生物细胞数量将

9、随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。4.稀释摇管法(dilutionshakeculturemethod)用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生