第二章微生物的纯培养和显微技术.ppt

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1、第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养第二节显微镜和显微技术第三节显微镜下的微生物微生物特点培养物（culture）:指在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。纯培养物（pureculture）：微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代，称纯培养。所得培养物成为纯培养物。有关概念第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术二、用固体培养基分离纯培养三、用液体培养基分离纯培养(常用稀释法)四、单细胞（孢子）分离五、选择培养分离六、微生物的保藏技术一、无菌技术(aseptictechnique)指在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技

2、术。消毒(disinfection)：指采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌,而对被消毒的物体基本无害的措施。(部分杀灭微生物)灭菌(sterilization)：指采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。(彻底杀灭微生物)又可分为：杀菌和溶菌两种。抑菌(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。防腐(antisepsis)：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。无菌(asepsis)：不存在活菌，多是灭菌的结果。1、微生物培养的常用器具及其灭菌火焰灼烧法干热灭菌法烘箱内热空气灭菌法高温灭菌

3、巴氏消毒法常压下煮沸消毒法间歇灭菌法湿热灭菌法常规加压灭菌法加压下连续加压灭菌法高压蒸汽灭菌锅2、接种操作接种工具：白金or镍铬合金接种针/环操作环境：超净工作台双管移植法二、用固体培养基分离纯培养指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。几种菌落用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。a:用接种环取一滴或少量待培养物在1处划线，接种环灭菌后,转动平板在2处划线,再对接种环灭菌后在3处划线。b:对平板培养后各处的菌落情况。2、倾注平板法（pourplate）先将待分离的材料用无菌水做一系列的稀释(如1

4、﹕10、1﹕100、1﹕1000、1﹕10000等等)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。又称稀释倒平板法(对一些热敏感菌和严格好氧菌不利)3、涂布平板法（spreadplate）先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。倾注平板法涂布平板法先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用

5、这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。稀释摇管法--------稀释倒平板法的一种变通形式三、用液体培养基分离纯培养(常用稀释法)四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞分离法。这种方法对操作技术要求较高，多限于高度专业化的科学研究中使用。采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、

6、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。五、选择培养分离六、微生物的保藏技术菌种保藏方法连续移接改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。1、传代培养保藏是微生物保存的基本方法。琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存。4℃保存。2、冷冻保藏代谢作用停止。细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细

7、胞壁者则比有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5%左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。3、干燥保藏法沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。沙土管保存一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子