第二章 微生物的纯培养和显微技术

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1、一、用固体培养基（营养琼脂平板）分离纯种微生物纯种分离2         将多种混杂微生物，经某种技术或方法分离成纯种的过程纯培养（pure  culture）1         在适宜条件下培养纯种获得的培养物（群体）培养物(culture)：在微生物学中，把人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物。菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，称为菌落(colony)。当固体培养基

2、表面众多菌落连成一片时，便称为菌苔(lawn)。大多数微生物能在固体培养基上形成独立的菌落，可采用平板分离得到。一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养；单个微生物只在固体培养基上形成菌落；在液体培养基中不会形成菌落不同微生物在特定培养基上形成的菌落或菌苔一般都具稳定特征，可成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立菌落，采用适宜的平板分离法很易得到纯培养。所谓（培养）平板，是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平

3、皿。固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基，可使每个孤立活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。（一）、微生物纯种分离的原理和方法不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立

4、的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板(cultureplate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基，每个孤立的话微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Koch建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。（二）

5、、纯种平板分离的不同方法1、稀释倒平板法（倾注平板法）（pourplatemethod)①待分离材料用无菌水作一系列稀释②取不同稀释液少许，与熔化且冷却至50℃左右的琼脂培养基混合③摇匀后，倾入灭过菌培养皿中④待琼脂凝固后，制成可能含菌平板，平板倒置在恒箱中培养。保温培养一定时间，可能出现在平板表面的单个菌落，该菌落可能是由一个菌体繁殖形成。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。2、涂布平板法（spreadplatemethod)由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成

6、某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法①、微生物悬液适当稀释②、稀释液放置在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上③、用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上④、恒温培养3、平板划线法（streakplatemethod）用无菌的接种环以无菌操作沾取少许待分离的培养物，在无菌的平板表面上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有扇形划线、连续划线、方格划线

7、、放射划线、四格划线等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。4、稀释摇管法（dilutionshakeculturemethod)培养厌氧微生物用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板

8、法的一种变通形式。对厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法。①、培养基熔化，冷却并保持在50℃左右，②、待分离的材料用培养基梯度稀释，迅速摇动均匀，③、冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，④、培养，菌落形成在琼脂柱的中间。挑取和移植单菌落。进行单菌落的挑选和移植，需要先用一只灭菌针将液体石蜡－石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。二、用液体培养基分离