抗多肽制备流程及原理.ppt

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1、抗多肽制备流程及原理11/11/81.抗原多肽的设计2.抗原多肽的偶联策略3.多肽合成简介4.抗多肽血清的制备5.血清的检测1.抗原多肽的设计为产生有效的抗体，第一步是设计好的抗原，此抗原可以来源于整个蛋白质的一部分：一个或几抗原决定簇区域的序列。（1）什么是抗原决定簇？蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。（2）选择抗原决定簇为选择好的抗原决定簇，应符合以下三点：1．亲水性(Hydrophilicity)：大部分抗原决定

2、簇是亲水性的；2．表面可接触性(SurfaceAccessibility)：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合；3．有弹性(flexibility)：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的N端及C端是很好的抗原决定簇区域。（3）抗原性与免疫原性单独的抗原决定簇是不能产生免疫反应，它只有抗原性但没有免疫原性，为使它能具有免疫原性，它必须偶联在载体蛋白上。（4）抗原决定簇的预测对每个氨基酸的表面可接触性、亲水性和弹性进行计算可以大体推算出抗原决定簇区域，抗原决定簇区域应综合以上三个特点。目前市面上有几个专业测定软件满足需要：如MacVestor

3、,Protean,GCG等。备注（5）设计多肽序列的长度抗原性区域确定以后，接下来要确定多肽的长度。关于选定多肽长度有两种不同的观点。一种观点认为长的多肽（20－40个氨基酸）比较好，因为长的多肽无疑会增加抗原基的数量。另一种观点则认为小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所产生抗体的位点特异性。但有一点是明确的，不管长度如何，所选多肽必须能够较容易地通过生化合成得到，并且能溶解到水溶性缓冲剂进行载体蛋白的耦联。由于受副反应的影响较大，高于二十个氨基酸的多肽通常很难进行高纯度合成，并且常常会含有缺失性序列。另一方面，太短的多肽（<10个氨基酸）则会产生识别特异性

4、很强的抗体，以至于无法识别整体蛋白，或亲和性很低。因此综合考虑制备性抗原地多肽有效长度一般是10－20个氨基。这种长度的多肽序列会最大程度的减小生化合成困难，具有一定的水溶性，也会具有一定程度的二级结构。（6）设计合成多肽一旦抗原序列决定后，接下来就是设计所需合成的多肽了，设计时除了注意其序列外，同时应考虑一些产生免疫机制问题，如：1．载体蛋白的接入位置。2．如果其序列是位于蛋白C端的，此多肽C端一定是自由的羧基团，而N端被掩盖。同时如果载体蛋白是通过半胱氨酸偶联，此半胱氨酸应处于N端位置，使C端完全暴露给免疫系统。3．相反，如果其序列是位于蛋白质N端，此多

5、肽C端应掩盖，暴露出N端，而载体蛋白应在C端。2.抗原多肽的耦联策略化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白耦联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽耦联的载体蛋白有多种，其中最常用的是(keyholelimpethemacyanin(KLH),牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA),卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovinethyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽耦联

6、载体。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。设计合成性多肽常常被忽略的一个方面是如何将多肽耦联到载体蛋白上。例如，N-端序列需要通过C-端氨基酸耦联，而C-端序列则需要通过N-端氨基酸耦联。内部序列则可以耦联到任何一端。内部序列耦联的另一考量则是将非共轭端酰基化或氨基化，因为原蛋白分子序列中不会含有带电荷的末端。最常用的耦联方法都是基于自由氨基(alph-氨基或Lys)、sufhydryl(Cys)或羧基集团(Asp,Glu,或alpha-羧基)的存在。所有的耦联方法都应该是通过羧

7、基或氨基端残基将多肽耦联到载体蛋白上。所选序列不能有多个残基都能参与所选耦联化学反应。如果多个反应位点存在，可以考虑将多肽序列缩短，或者选择所有反应位点都位于一端的多肽。对于内部序列通常会使用离所预测抗原位点较远的一端进行耦联，这样可以避免可能的屏蔽问题。除非研究人员另做说明，我们通常使用EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)或carbodiimide方法将多肽和载体进行耦联。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸的侧链羧基集团及末端羧基集团，使之与主胺基发生

8、耦联反应。激活的多肽与载体蛋白混合而产生最终的共轭体