多肽抗原的设计与抗体制备ppt课件

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1、多肽抗原的设计与抗体制备多肽抗原的设计多肽的固相合成和纯化多肽的交联和免疫抗多肽抗体的检测和功能学鉴定抗体的纯化怎样利用Internet的免费资源寻找与抗体相关的信息抗合成肽类抗体制备程序免疫原性肽的选择肽的合成、纯化与鉴定载体蛋白的选择连接剂的选择载体蛋白/肽连接物免疫动物McAb的制备ELISA筛选抗体血清反应性收集阳性血清Westernblot,Immunofluorescenceassay鉴定抗体的生物学功能阳性抗体的纯化抗体制备常用的免疫原1：表达纯化一段或全长的重组的带GST,Histag的融

2、合蛋白Abnovacorporation2：利用合成肽制备抗体AVIVASYSTEMSBIOLOGYLIFESPANBIOSCIENCES3：利用纯化的天然蛋白免疫原性肽选择的基本程序利用在线设计软件或DNAStar筛选抗原性强的多肽序列尽量使用N端或C端的序列该序列经Blast后在人的其他蛋白中同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高度保守用peptidecompanion软件判定易于合成的14-16个氨基酸免疫原性肽选择的注意事项避开信号肽，磷酸化，糖基化位点避开很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如

3、zincfinger，SH2domains，GTPbindingsites。有些蛋白在成熟的过程中会切割掉一小段肽段。如果选用MBS交联方法，需要在N端或C端加上C对于有些基因来说，可能含有不止一个转录异构体（transcriptvariants），这时就要在这些转录异构体的共有序列中寻找抗原多肽利用Swiss-Prot数据库辅助设计..UniProtKB-Swiss-ProtentryP26992[CNTFR_HUMAN]Ciliaryneurotrophicfactorreceptoralpha.h

4、tm多肽的固相合成此法的基本过程是：基于Fmoc化学合成，将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子保护性氨基酸的羧基（已经活化）作用（用NMM,HBTU作偶联剂）形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。合成原料Fmoc-AA(prot)-Wangresin提供肽链延伸反应的固相颗粒状介质例如：Fmoc-His(Trt)-WangresinProt：Boc,tBu,Tr

5、t,OtBu侧链活性位点的保护基团Fmoc:α-NH2保护基团：Boc:Trt:Fmoc-AA(Prot)-OHSolvent1:DMFSolvent2:20%pipdine/DMFSolvent3:0.4MNMM/HBTU/DMFSolvent4:50%ACN/DMFSolvent5:methylenechlorideSolvent6:94%TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O标准合成程序Stepsolvent/operationvolumemixtimedrainRep1DMF10

6、0:00:30on3220%pipdine/DMF100:07:00on23DMF100:00:30on64Reagent(AA)100:00:00off150.4MNMM/HBTU/DMF100:40:00on16DMF100:00:30on3标准切割程序Stepsolvent/operationvolumemixtimedrainRep1DMF100:00:30on3220%pipdine/DMF100:07:00on23DMF100:00:30on64methylenechloride100:00:

7、30on65Dry100:10:00on16TFA202:00:00on17TFA100:00:30on18methylenechloride100:00:30on39Dry100:02:00on1多肽合成的一般常识固相多肽合成一般最多只能合成到20aa。为了保证合成的效率和纯度，我们在设计多肽抗原时，一般设计14-16aa的多肽。减少多肽序列中多个困难性氨基酸Cys,Met,Arg,orTrp的含量。避免多肽序列中连续3到4个疏水性的氨基酸。（Val-V，Leu-L，Ile-I，Met-M，Phe-F）

8、避免Asp-Pro序列避免多肽序列中最后一个氨基酸是Pro。PIWIL3SR0015FFLKHGSNFQNPPPCaspase2SR0024TDTVEHSLDNKDGPCaspase7SR0032DRVARHFESQSDDP切割完以后，用乙醚沉淀什么都没有多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。Ago2SR0009IVEHMVQHFKTQIF极难溶DGCR8SR0004L