标记物及其与抗原抗体的结合物制备ppt课件

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1、临床免疫学检验技术第四章标记物及其与抗原抗体的结合物制备汪付兵/R·20107目录第一节标记物种类及特性第二节常见交联剂的种类及特性第三节放射性核素与抗原抗体结合物制备第四节荧光素与抗原抗体结合物制备第五节酶与抗原抗体结合物制备第六节化学发光剂与抗原抗体的结合物制备第七节稀土离子与抗原抗体的结合物制备第八节量子点与抗原抗体的结合物制备第九节胶体金与抗原抗体的结合物制备第一节标记物的种类及特性重点提示放射性核素荧光物质酶和酶作用底物化学发光剂量子点胶体金第一节标记物的种类及特性标记免疫技术=免疫技术+标记技

2、术抗原抗体反应示踪标记物高特异性高灵敏性精密仪器检测高精密性既可以与抗原或抗体相结合，又可以被相应的仪器所检测的物质，这就是标记物标记物在免疫分析中的作用在于示踪标记并能够被检测放射性核素125I特点化学性质较活泼，标记方法简单，容易获取高比活性的标记结合物；衰变过程不产生电离辐射强的β射线，对标记多肽，蛋白抗原分子的免疫活性影响小；衰变过程中释放γ射线，可用γ计数器测量，方法简便，易推广应用；半衰期(60天)适中、核素丰度(>95％)及计数率相对较高。二、荧光物质有机化合物荧光素稀土离子螯合物荧光底物（

3、酶作用后产生荧光的物质）荧光素异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）四乙基罗丹明（rhodamine,RB200）四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）藻红蛋白(phycoerthrin,PE)常用的荧光素特性荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm

4、（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术稀土离子镧系元素属于三价稀土离子，包括铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、铽(Tb3+)、钕（Nd3+）、镝（Dy3+）和铈(Ce3+)等。铕是标记抗原抗体应用最广的元素。游离的稀土离子荧光比较弱，但与适当的螯合剂如β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（PTA）等形成螯合物后，可使荧

5、光得到增强。稀土离子的荧光特性如下：具有较大的Stokes位移，发射光谱和激发光谱不会相互重叠。荧光寿命长，荧光半衰期介于10-1000μs之间。激发光波长范围宽，发射光谱带很窄，甚至不到10nm。其他荧光物质某些化合物本身无荧光效应，但经酶催化后便具有强荧光。如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷，受β-半乳糖苷酶的作用后分解成4-甲基伞酮，可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物（4-甲基伞酮磷酸盐）和辣根过氧化物酶的底物（对羟基苯乙酸）等，都具有荧光底物的性质。三、

6、酶和酶作用底物常用的酶标记物有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)每种酶可与相应的显色或发光底物作用，产生典型的有色反应物或化学发光反应，通过反应的颜色或发光强度对被检物进行定性、定量分析。辣根过氧化物酶HRP辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）　　　与275nm（主酶）OD值

7、之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶碱性磷酸酶ALP及β-半乳糖苷酶碱性磷酸酶（AP）菌源性AP肠粘膜APβ–半乳糖苷酶（β-Gal）用于均相酶免疫测定HRP底物HRP的底物DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高HRP的常见底物邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物OPD反应后显橙黄色，

8、加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。HRP的常见底物对羟基苯乙酸（4-hydroxyphenylaceticacid，HPA）HPA具有荧光底物性质，在H2O2存在下被HRP氧化成二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光。H2O2HRP+荧光氧化二聚体ALP底物常用