TG电转感受态制备与主要影响因素.ppt

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1、大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化2014-12-23相关概念实验原理方法特点实验步骤影响因素感受态细胞受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的一种细胞状态。转化是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。一、相关概念二、实验原理化学方法CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于0～4℃的CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合

2、物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃、90秒热激处理，促进细胞吸收DNA混合物。DNA分子通过复制、表达、实现遗传信息的转移，使细胞获得新的遗传性状。常制备的感受态菌株：DH5α、TOP10、DE3、JM109等。电转化法电转化法利用瞬间高压电脉冲，使细胞表面产生暂时性的孔隙，可在细胞膜表面形成小孔，同时由于电击作用可促使细胞膜融合，最后在细胞膜上形成大的孔道，易于DNA进入。常制备的感受态菌株：TG1。化学感受态细胞制备取－70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3mlLB培养液

3、的试管中，37℃振荡培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基的500ml烧瓶中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）。当菌落600nmOD值达到0.3－0.4时，将烧瓶取出放置冰上10~15分钟。在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。4℃,4000g离心10分钟。弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加10ml0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。4℃,4000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液.加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体。每管0.2ml分装，

4、至4℃保存备用，24－48小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于－70℃的低温冰箱中。TG1电转感受态细胞的制备用10ul无菌枪头挑取TG1单克隆划线接种于2YTG板(2YT培养基中加2％的葡萄糖)，37℃过夜培养。挑取TG1单克隆到25ml2YT培养基中，250rpm、37℃过夜培养。早上将摇过夜的菌液分别取5ml接种于2个500ml的2YT培养基中，250rpm、37℃摇到OD600≈0.6。下面的操作全部在冰上进行：将摇好的菌液在超净台中分装到2个无菌的500ml离心杯中，4℃、3000rpm离心10min。在超净台中小心倒去上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，加预

5、冷10％甘油到总体积500ml。4℃、3000rpm离心10min。倒去甘油上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，将菌液转到一个离心瓶中。加预冷10％甘油到总体积500ml。另一个离心瓶用水平衡。4℃、3000rpm离心10min。倒去甘油上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，加预冷10％甘油到总体积250ml。另一个离心瓶用水平衡。4℃、3000rpm离心10min。倒去甘油上清液，2.5ml的预冷10％甘油重悬菌体，用无菌枪头吸取100ul/管转入1.5ml微量离心管中（离心管作好标记且在-80℃冻存至少半小时）。马上用于电转或将离心管马上放入液氮中，冻存至少1小时，再放

6、入-80℃冻存。各方法特点一般的构建重组菌株，化学法都可应对但在构建大容量基因文库和抗体库时，必须提高转化效率，采用电转化方法是最佳的途径。E.Coli的生长曲线从0～4h，测定E.coli的细菌浓度(A600nm)，绘制对数期生长曲线(A600nm≤1)，如图所示。E.coliTG1和E.coliDH5a的生长曲线均在100min后开始成对数生长趋势，在100～15Omin之间，E.coliTG1菌株的生长速度比E.coliDH5a菌株快。E.coliDH5a在不同时间的转化效率注：电击杯间隙为0．2cmE.coliTG1在不同时间的转化效率注：电击杯间隙为0．2cmE.coli在

7、对数期不同时间的转化效率探讨选用对数生长期的细胞的感受态细胞是提高电转化效率的一个重要的因素。如果选择没有达到对数生长期或超过对数生长期的细胞，转化效率很低。对对数生长期大肠杆菌菌株(A600nm在0．2～1．0之间)的电转化效率作了比较，通过E.Coli的生长曲线图可以看出两种菌株的生长趋势基本一致，只是在前、中、后期的持续时间存在差异。结合E.coli在不同时间的转化效率可以看出，在相同条件下制备的感受态细胞，大肠杆菌(Escherichiacoli)