高效感受态制备

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1、咼效感受态制备SOB/SOC培养基（平板）专用:9.5g/20.3g24g/49.3g1MMgCI2(10ml/1L)无水MgCI2/MgCI2-6H2O蒸锚水100ml0.25MKCI1.86g100mlKCI蒸馄水2MMgSO4(10ml/L)MgSO4/MgSO4«7H2O蒸镭水100ml以上试剂121°C高压蒸汽灭菌20min,室温储存2M葡萄糖（10ml/L）葡萄糖36g蒸谓水100ml过滤灭菌，室温储存5MNaOHNaOH20g蒸谓水100ml无需灭菌，室温储存于塑料瓶，配制过程产高热（!），可在冰上边搅拌边缓慢加入颗粒SOB培养基配方（1L）胰蛋白腺20g酵母粉5gNaCI0

2、.5g加5MNaOH调pH=7.0,定容，121°C高压蒸汽灭菌20mirio用前加10ml1MMgCI210ml0.25MKCISOB平板：SOB培养基加入1.5-2.0%琼脂，20mMMgSO4和适量抗生素SOC培养基配方（100mL）（转化时用，可先不配）SOB培养基dOOmL）60°C以下加入1ml2M葡萄糖转化缓冲液TB（500mL）PIPES/MOPSMnCI2/MnCI2-4H2OCaCI2-2H2O/CaCI2KCI加MilliQ水至约450ml,1.51g/1.05g(10mM)3.46g/5.44g(55mM)1.10g/0.83g(15mM)9.33g(250mM)加

3、5MKOH调pH6.7-6.8,用MilliQ水定容至500mL过滤除菌,存放于4°C棕色瓶中（可保存半年以上）。5MKOH28g100mlKOHMilliQ水液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.C0L1DH5a,JM109,HB101等，在LB/SOB平板上划线,37度过夜（16-20h）至长出单菌落.挑直径2-3毫米的单菌落（可多个），接种到含25mlSOB的250ml锥形瓶中，37°C250-300rpm培养6-8h。晚上6点转接到两个含100mlSOB的500ml锥形瓶中，一瓶接0.4ml菌种，另一瓶接3.2ml,在18°C225-250rpm培养（15-50小吋，依所用菌种和条件

4、有所差别），次日上午约9-10点开始测0D600（45min/次）当有一瓶OD600达0.55（—般不要高于0.6）时停止培养，另一瓶放弃，若不小心生长过度（OD600>0.6），则使用另一瓶，在OD600达0.55时停止培养。放在冰水中冷却10分钟，分装菌液于两个冰上预冷的灭过菌的50ml离心管中。4°C低温2000g（约3900rpm）离心10分钟，收集菌体倒掉上清后，倒扣离心管于一块灭过菌的纱布上约1min以吸干管内剩余液体，或用枪吸干管壁上和管底培养基。加入2*20ml（约原菌液的1/3体积）的冰冷TB溶液，轻轻旋转悬浮菌体，不要震荡或吹吸混匀。放置冰上约10min后，4°C低温2

5、000g（约3900rpm）离心10分钟，收集菌体倒掉上清后，倒扣离心管于一块灭过菌的纱布上约1min以吸干管内剩余液体，或用枪吸干管壁上和管底培养基。加入2*4ml（原菌液的1/12.5体积）的冰冷TB溶液，轻轻旋转悬浮菌体，添加2*0.3ml的DMSO（最终浓度为7%）,轻轻旋转混匀，冰上冷却10分钟，迅速分装到冰上预冷的1.5mlEP管中（0.1・1.0ml/管），用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻1min,取出感受态放入・70°C超低温冰箱备用。注意问题：1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。此法最重要

6、是试剂在于TB溶液，最好要用MilIQ水配制，若用三蒸水可能会大大降低转化效率(未尝试过，根据经验所做推测)，因MOPS或PIPES对光和热敏感，所以一定要用过滤除菌，除菌后保存于棕色瓶。培养基可用普通去离子水即可。2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长岀来的菌体是做不岀效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250mL3、培养基的pH值。这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而口还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般來说，接种前的pH值在6.8-7.2,等菌

7、摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0,最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。4、培养后的0D值。其实这并一个非常重要的参数，只是当0D值大到一定的程度后，菌体要保持对数生反已经不太可能，因此很多指导方法上强调0D不得大于0.6,0.8等等。同时,0D值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在0D值的两方面影响中找一个平衡点。5、培养基屮的各种离子。经验证明，