大肠杆菌感受态的制备.ppt

《大肠杆菌感受态的制备.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验二、大肠杆菌感受态的制备一、实验原理目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的ＤＮＡ片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的ＤＮＡ分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源ＤＮＡ分子的

2、受体细胞。二、实验所需器材和试剂器材：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪。试剂：1.LB固体和液体培养基。2.含特定抗生素的LB固体培养基。3.100mMCaCl2溶液。4.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。5.待转化质粒。三、实验步骤1.挑取一DH5α单菌落于5mlLB培养液中37℃过夜培养2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至

3、OD600值达到0.5-0.6之间3.取50ml菌液置于离心管内，4℃4500g离心5分钟4.加入30ml,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟5.4℃4500g离心5分钟收集细胞后，加2ml,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。取其中一份进行转化。7.向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟。8.将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移

4、到冰浴，冷却1－2分钟。9.向管内加入800ul的LB培养液。然后37℃培养45分钟。10.取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟11.倒置平板于37℃培养12－16个小时。四、实验注意事项为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量:所用的试剂

5、,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。五、本实验所需要掌握内容掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。