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1、大肠杆菌感受态的制备原理:热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106～107转化子/µgDNA。材料：Top10、pcDNA3.0,TBbuffer（现用现配）、超纯水、碎冰。LB液体培养基200ml（不含AMP）、LB固体培养基（含AMP）、LB固体培养基（不含AMP）10ml圆底离心管（玻璃或塑料）、100ml锥形瓶、2.0ml离心管、各型号枪头,刻度移液管均需灭菌处理甘油：100ml(高压灭菌)氨苄（母液100mg/ml，终浓度为100ug/ml）：1ml母液需氨苄100mg过滤除菌。仪器：滤器、0.22um
2、微孔滤膜、刻度吸量管、恒温摇床、恒温培养箱,分光光度计、比色杯、低温离心机、制冰机、超净工作台,移液器。步骤：1）从冻存的E.coli.Top10,划线接种至LB固体培养基（不含AMP）.37℃培养O/N,16h左右。2)从新活化的E.coli.Top10菌平板上挑取一单菌落，接种与2mlLB液体培养基（10ml圆底离心管）中，37℃振荡培养O/N,16h左右。备注:E.coli.Top10,20%无菌甘油,－70℃保存。3)将该菌悬液以(400UL)1:100～1:50转接于20mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液明显混浊后，2.5~3小时后测一次OD(600nm)，至OD
3、600nm≤0.6时停止培养.摇菌期间,配TBbuffer，开制冰机。TBbuffer置于冰上预冷(20~30分钟).低温离心机预冷(20~30分钟)以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4）细菌置于冰上,10min。5）取12管,1.5ml细菌培养液3000g4℃离心5min,弃上清。6)每管加200ul预冷的LB，轻轻混匀,均成2管,置冰上20~30分钟，3000g4℃离心5min,弃上清。备注:5)和6)是为浓缩细菌.细菌置于冰上,10min。7）每管加1ml预冷的TBbuffer，轻轻混匀，置冰上20~30分钟。8)3000g4℃离心5min,弃上清。重复7)和8)9）加入50ul预冷
4、的TBbuffer，不要重悬或轻轻重悬，置4℃过夜备用。提高转化效率吗？10)(可选)添加冷冻保护剂（15%-20%甘油）后,超低温冷冻贮存备用（-70℃）转化1.50ul感受态+1ul质粒2.冰浴30min。此时打开水浴锅预热。3.42℃水浴90s,置于冰上2分钟。4.加1mlLB培养基（不用预冷、不含Amp）,混匀后转移到10ml圆底离心管中37℃震荡1h,4000rpm离心5min,弃部分上清。5.铺板，将上述摇匀的菌液取20ul和100ul涂于含Amp的筛选平板上，正面向上放置30min,待菌液完全吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。6.挑取一单菌落，菌落PCR鉴定正确。接种
5、与2mlLB液体(含AMP)培养（10ml圆底离心管）中，37℃振荡培养O/N,16h左右。提取质粒,PCR鉴定,酶切鉴定,测序鉴定。20%无菌甘油,－70℃保存。LB液体培养基：蛋白胨：1.0gNacl:3.0g酵母粉：0.5g用1N的NaOH调节PH=7，ddH2O:100ml蓝盖瓶,高压灭菌后使用，冷却至55℃左右加入Amp，常温备用。LB固体培养基:蛋白胨：1.0gNacl:3.0g酵母粉：0.5g琼脂糖:1.5gddH2O:100ml高压灭菌后，冷却至55℃左右加入Amp，铺板，倒置。先在常温下放置几小时-O/N.4℃备用。TBbufferHepes.Na:0.13g无水CaCl
6、2:0.083gKCl:0.932gMncl2.4H2o:0.544gddH2o:50ml先将前三者用超纯水溶解，用1N的Hcl调PH至6.7，不能调过，如果调过，需要重新配制。调好PH至6.7后，再加入Mncl2.4H2o溶解，最后定容至50ml。注意事项1.细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5a菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2.化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000
7、倍）；3.所有操作均应在无菌条件和冰上进行；4.计算rpm和（RCF）g.G＝1.119×10（－５）×r×（rpm）２5.所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率.6.TBbuffer现配,调PH,过滤除菌，过滤后的溶液置于无菌容器中。7.100ml储存用的LB培养基高压后4℃保存（用蓝盖瓶）。100ml储存用的ddH2o高压后常温保存，用时1.5ml的EP管分装。LB培养基配好
