大肠杆菌感受态的制备.doc

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1、大肠杆菌感受态的制备(1)取出保存在-80℃的甘油菌种，取1μl接种在1mLLB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜；(3)按照1：100的比例转瓶于50mLLB液体培养基。37℃剧烈震荡；(4)待菌生长到对数中期OD600=0.4~0.6，约需要几小时，然后将菌液转入50mL无菌离心管中，在冰上放置15分钟，待菌液冷却后于4℃、8,000rpm离心4分钟，收集菌体，弃去培养液；(5)在沉淀中加入O.1M预冷的CaCl220mL，洗涤重悬菌体，离心收集，弃去上清液；(6)加入0.1MCaCl2(冰上预冷)2mL重悬菌体。置

2、于冰上，48小时内均可使用，12小时后大肠杆菌感受态细胞效率将提高3~4倍；加入0.5mL无菌甘油使其终浓度为20％(v/v)，以每管100μl分装于1.5mL无菌离心管中，-80℃保存待用。大肠杆菌的转化1)将从-80℃冰箱中取出的200μl感受态细胞放在冰上融化。2)加入5-10μl的质粒或连接产物，轻轻混匀内容物，冰浴30min。3)将EP管迅速放入42℃的水浴中热激2min。4)快速将EP管转移到0℃冰浴中，使细胞冷却2min。5)每管加入800μlSOC活化培养基，37℃，180r/min摇床培养1h。6)最后离心2m

3、in，将菌体涂布于LB+抗生素的平板上，将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平板，于37℃培养，12～16h左右可出现菌落。农杆菌8的菌株活化与感受态的制备(1)取出保存在-80℃的C58甘油菌种，取1μl接种在1mLLB液体培养基中，28℃，200rpm培养过夜；(2)按照1:100的比例转瓶于50mLLB液体培养基，LB培养基中加50mg/L的硫酸庆大霉素。28℃200rpm震荡培养过夜；(3)等OD600为0.4~0.6时停止培养，约需8h左右；(4)将菌液转入50mL无菌离心管中，在冰上放置30分钟，不时缓慢摇匀以保证内容

4、物充分冷却。待菌液冷却至4℃，2,500rpm离心15min，将菌体收集于管底，并弃去上面的培养液，用50mL冰冷的纯水垂悬沉淀。(5)4℃，2,500rpm离心20min，以回收细胞，倒去培养液，用1mL冰冷的10%甘油垂悬沉淀。(6)4℃，2,500rpm离心20min，以回收细胞，倒去培养液，用1mL冰冷的10%甘油垂悬沉淀。倾倒培养液时要小心，10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。(7)4℃，2,500rpm离心20min，以回收细胞，小心倒去上清液，再吸去管壁上的残留液体。用1mL冰冷的LB培养液垂悬沉淀，这一步要轻柔摇动

5、完成，防止吹打或振动。(8)100倍稀释上述悬液后测量OD600值。用冰冷的LB培养液将其稀释至浓度为2×1010~3×1010个细胞/mL(1.0OD600=~2.5×108)。(9)-80℃保存备用。农杆菌C58的电转化1)取1~2µlDNA于40μl感受态细胞中，冰上放置冷却。2)加入冰预冷的0.1cm电击杯中，轻击电击杯使悬液位于其底部。调节电脉冲，电压和电阻至需要值，启动对细胞的电脉冲。3)电击后尽可能快地取出样品池，加入lmL冰预冷的SOC培养液，28℃摇床培养2~4h(180rpm)。4)5000r离心5分钟，沉淀

6、细胞，弃上层培养基约600μl。5)涂板在含相应抗生素的平板上，室温下待培养板中的液体被完全吸收。28℃培养24h左右即可出现阳性菌落。浸花法转化拟南芥在直径10cm的小盆中装上营养土，然后用改良的Hoagland培养液将营养土浇透，将拟南芥种子播种于小花盆中，播种前种子加少量水置于4℃春化2～3d，播好的种子放入23℃、连续光照的气候室培养，待拟南芥开始抽苔之后，切掉主苔，待侧枝伸出2～10cm时，顶端有较多未开放的花苞时进行转化。挑取C58质粒的农杆菌单菌落于5mL的LB培养基（50mg/LKan,50mg/LGen）中，2

7、8℃、250r/min培养约2d后，以1：100的比例转接到500mLLB培养基中，摇培至OD6000.8左右，5000r/min离心15min，将离心所得菌体重悬于渗透介质（1/2MS盐，1倍的维生素B5，50g/L蔗糖，0.5g/LMES，0.044µmol/L6-BA，200µL/LSilwetL-77，用5mol/LKOH调pH至5.7）中，将菌液倒入小烧杯，稀释至OD600为0.8左右，将待转化的拟南芥连同花盆倒浸于渗透介质中，浸泡3～5min后，将处理好的拟南芥用长且干净的保鲜袋包好，保持湿度，黑暗中放置，第二天去掉

8、保鲜膜，放在室温中，并给拟南芥充足水分，营养，继续培养至种荚开始变黄，大约4w后，将植株上半部分剪下，用纸包好，待种子彻底干燥后，收种子保存在EP管里，待筛选。