感受态制备、蓝白斑筛选.ppt

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1、分子医学实验感受态细胞的制备质粒转化入大肠杆菌及初步筛选复习：基因克隆示意图基因克隆操作过程：分分离载体和目的基因切限制酶切载体与目的基因接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体基因工程一、感受态细胞及重组体转化重组体转入受体菌受体细胞转化（transformation）转染（transfection）转导（transduction）转化是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。转染是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞;转导则是指病毒从被感染的细胞(供体)释放出来，再次感染另一细胞(受体时)，发生供体细胞与受体细胞之间的DNA转移

2、及基因重组。重组DNA分子导入受体细胞的手段转化方法CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态细菌重组体转入细菌感受态(competent)：宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞.正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增大，处于感受态。制备感受态细胞和转化的常用方法CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5106－210

3、7转化子/g质粒DNA，简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。电穿孔转化法、脂质体(liposome)法、胞核的显微注射法(microinjection)；磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细菌处于冰冷（0℃）0.05～0.1M的CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。同时在转化体系中的DNA形成的抗DNase的羟基-钙磷酸复合物能粘附于细菌表

4、面，经过42℃短时间热休克（heatshock）处理，促进感受态细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养(selectiveculture)平板上即可筛选出所需的转化子。0.1mol/LCaCl20℃重组体感受态细胞转化(transformation)：在分子克隆技术中，转化特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。区别转化、转染(transfection)与转导(transduction)转化与感受态细胞二、感受态细胞制备及重组体转

5、化的实验操作及注意事项细菌转移到一冰冷的1.5ml的EP管，40C，4000rpm×5min弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/LCaCl2300μl，重悬菌体，冰浴20min40C，4000rpm×5min弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净沉淀中加入冰冷的0.1mol/LCaCl2100μl，重悬菌体。冰浴10min冰浴10min后每管加入质粒5l轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置20min试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动试管迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min取出试管后，每管加入LB培养

6、基800l，置于370C摇床（100~150r/min），温和震荡45min用无菌弯头玻璃铺菌器将200l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面室温放置20min，使液体被吸收（发汗）倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长三、重组体的筛选重组体克隆的筛选与鉴定由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA的阳性克隆。筛选的依据：基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。筛选的方法：抗药性标志的选择插入表达筛选-半乳糖苷酶系统筛选（-互补）(-半乳糖苷酶能将X-gal转变为不

7、溶性的深蓝沉淀）(插入失活法)抗药性标记选择目录菌落杂交筛选法内切酶图谱鉴定PCR筛选重组子Southern印迹杂交和菌落原位杂交DNA序列分析免疫化学检测法原理：基因载体上含有ß-半乳糖苷酶（LacZ)的基因，当外源DNA插入到载体的LacZ基因上后将造成ß-半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有X-gal-IPTG（异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷）培养基的颜色变化直接观察出来。蓝白斑实验α互补的检测目录U6原位杂交目录Sou

8、thern印迹目录鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录预期结果pUC119含空载体pUC119的蓝色菌落含pUC119-u6的白色菌落pUC119-u6培养基：Amp＋X-gal培养基：Amp＋X-galThankyou！