西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70 cDNA的克隆、序列分析和组织分布.pdf

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1、第27卷第2期2012年4月大连海洋大学学报JOURNALOFDALIANOCEANUNWERSITYv01．”No．2Apr．2012文章编号：2095—1388(2012)02-0150—08西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70cDNA的克隆、序列分析和组织分布田照辉，徐绍刚，王巍，胡红霞，董颖，宋超(国家淡水渔业研究中心暨北京市水产科学研究所，北京100068)摘要：采用普通PCR和RACE技术克隆了西伯利亚鲟Acipenserbaerii热休克蛋白HSP70eDNA的全序列，该序列全长为2343bp

2、，其中5’非编码区为140bp，3’非编码区为256bp，可读编码框(ORD为1947bp，编码为648个氨基酸。该氨基酸序列中含有HsP70家族的3个特征序列——IDLGrrYS、IFDLGGGTFD．VSIL和WLVGGSTRIPKIQK，细胞质特征性保守序列为EEVD，C端重复序列为GGMP。该cDNA序列与其它生物的HSP70eDNA序列一样具有很高的相似性。系统发育树显示，西伯利亚鲟与非洲爪蛙蟾Xenopuslaevis、密西西比短吻鳄Alligatormississippiensis、美西

3、螈AmbystomaJn“沁n啪的亲缘关系较近。实时定量分析结果表明，水温为17．5℃时，西伯利亚鲟肝脏、鳃、脾脏、心脏、肌肉、中肠、性腺、脑8种组织中均有HsP70表达，其中HSPT0在脾脏中的表达量最高，鳃中的次之，肝脏中最低(P<0．05)。关键词：西伯利业鲟；HSPT0eDNA；序列分析；组织分布中图分类号：$917．4文献标志码：A热休克蛋白(Heatshockproteins，HSPs)又称应激蛋白。其中HSP70家族高度保守，当机体遭受应激后会被诱导而迅速表达。HSFr70具有分子伴侣功

4、能，可以提高机体对应激因子的抵抗能力，在免疫过程中具有重要作用¨西j。热休克蛋白因具有广泛的生物学功能而成为研究热点。一些学者对黄颡鱼、团头鲂、剑尾鱼等多种鱼类的HSP70基因进行了克隆和研究”母j，还有学者建议将HSP70的表达作为潜在性的环境应激和毒性量化指标¨0。。西伯利亚鲟Acipenserbaerii属鲟形目、鲟科、鲟属，为亚冷水性鱼类。该鱼的养殖利润较高，因而成鱼养殖得到迅速推广。在成鱼养殖过程中，养殖户的盲目选址以及为追求产量加大鲟的放养密度，由此而引起的拥挤胁迫和夏季水温过高引起的高温

5、胁迫时有发生，致使西伯利亚鲟抗病力下降，病害增加。本研究中，作者首次克隆了西伯利亚鲟HSP70cDNA的全长，并对其在各组织中的分布进行了分析，旨在为研究HSPT0在西伯利亚鲟抗应激过程中的作用和机理奠定基础。1材料与方法1．1材料试验用西伯利亚鲟取自北京市水产科学研究所国家级鲟鱼良种场，其中1尾(150g)用于基因克隆试验，3尾(165g±23．46g)用于组织分布试验。RNeasyminikit提取试剂盒和RNase—FreeDNaseSet为Qiagen公司产品；TrizolReagent、DN

6、aseI、RT—PCR试剂盒购于Invitrogen公司；Ex．Taq、SMARTRACEeDNAAmplificationKit(Clon-tech)和pGM一19TVector载体连接试刺盒购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒为Axygen公司产品；实时定量试剂为AB公司生产的2xSybrgreenPCRMasterMix。克隆菌株DHl0B由北京市水产科学研究所生物技术与育种研究室保存。1．2方法1．2．1引物合成及测序所有引物用Primer5．0收稿日期：201l一05—27基金项目：农业部公益

7、性行业科研专项(201003055—05)；北京市农林科学院青年基金资助项目(QNJJ201015)作者简介：田照辉(1973-)．女。高级工程师。E—mail：zhl973@126．啪通信作者：胡红霞(19"／2一)，女，博士，高级工程师。E-mail：huhong血l@yah∞蛳∞第2期田照辉，等：西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70cDNA的克隆、序列分析和组织分布151设计(表1)，其中中间片段引物HSPFPl、HSPRP'2根据GenBank中登录的白鲟、鲤、斑马鱼、鲑的HSP70基因保守区设计，

8、其中3’HSPl、3’HSP2为3’RACE特异引物，57GSPl为5’RACE特异引物，2010722F和2010722R为克隆OFR引物，4f和4r为实时定量引物。所有引物合成及序列测定均由北京擎科生物工程有限公司完成。表1试验用引物Tab．1Prime礴usedintheexperiment1．2．2HSP70eDNA全长序列的获取1)总RNA的提取。取l尾西伯利亚鲟(150g)于水温为24℃的水池中暂养1周，再转人水温为30℃的水池中急性热应激1