前列腺癌组织中sod2的cdna克隆及其序列分析

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1、前列腺癌组织中SOD2的cDNA克隆及其序列分析作者：王明臣王好东张善锋王红钢臧明玺赵国强【摘要】目的构建前列腺癌组织中SOD2的cDNA克隆，并进行序列分析。方法从人前列腺癌组织细胞中提取总RNA并逆转录成cDNA,PCR扩增cDNA片段,将cDNA克隆入载体pGEMT中构建TA克隆,对阳性克隆进行序列测定分析。结果在1例前列腺癌组织标本中发现了SOD2基因的两个相连的点突变位点：372ntT→G颠换和373ntG→T颠换。蛋白序列比较分析显示：对应SOD2编码蛋白的第89位氨基酸由亮氨酸变为精氨酸。结论SOD2基因突变在前列腺癌的发生中可能起重要作用。【关键词】锰超氧化物歧

2、化酶；逆转录聚合酶链反应；分子克隆；序列测定【Abstract】ObjectiveToconstructthecDNAcloneofsuperoxidedismutase2(SOD2)inprostatecancertissuesandanalyzethesequence.MethodsTotalRNAprostatecancertissues,andthenplifiedethodandinsertedintopGEMTvectortoconstructTAclone,andthentheDNAsequenceofpositivecloneed.ResultsTutatio

3、nsitesofSOD2geneaspecimen:thetransversionof372ntT→Gand373ntG→T.TheparativeanalysisofcorrespondingprotEinsequenceindicatedthattheleucineat89siteutationmayplayanimportantroleinthepathogenesisofprostatecancer.【Keyutase;RTPCR;Molecularcloning;Sequenceanalysis前列腺癌发生的确切分子机制尚未阐明。研究表明,活性氧(ROS)参与肿瘤的启动

4、和促进过程〔1〕。超氧化物歧化酶2(SOD2)基因编码含锰超氧化物歧化酶(MnSOD)，是体内主要的超氧阴离子自由基清除剂，保护细胞免受ROS的损伤。近年研究发现,SOD2的基因表达量伴随细胞的癌变过程呈正相关下降,提示SOD2基因系潜在的新型肿瘤抑制基因〔2，3〕。本研究采用RTPCR技术，构建人前列腺癌组织SOD2基因的cDNA克隆并进行序列测定，期望揭示前列腺癌的发生是否与SOD2基因的突变及异常表达有本质联系。1材料与方法1.1样本的采集与处理收集2003年～2005年间7例前列腺癌患者手术后的肿瘤组织样本及20例良性前列腺增生患者的组织样本（样本来源于平顶山煤业集团总医

5、院，郑州大学一、二附院,河南大学二附院）。所有标本取出后立即放入无RNase的EP管中并放入液氮中保存待测。所有病人术前均未行化疗。1.2SOD2引物设计与合成SOD2扩增上游引物：5′CAACGCGCAGATCATGCAGC3′（130～149）；下游引物：5′GGCCTGTTGTTCCTTGCAGT3′（530～511）。由上海生工公司合成，经PAGE纯化。1.3TA克隆通用鉴定引物SP6：5′CATACGATTTAGGTGACACTATAG3′（2845～2867bp）；T7：5′TAATACGACTCACTATAGGGAGA3′（85～63bp）。由上海生

6、工公司合成，经PAGE纯化。1.4cDNA的合成应用Qiagen公司总RNA提取试剂盒提取RNA。采用的逆转录反应体系：5×RT缓冲液6μl，10mmol/L4×dNTP2μl，通用引物1μl，RNasin40U,AMV5U,提取总RNA5μl,DEPC水补足30μl，42℃水浴逆转录1h。1.5PCR扩增人SOD2的cDNA扩增反应体系：逆转录所得cDNA5μl,SOD2上、下游引物各0.5μl，10×缓冲液3μl，10mmol/L4×dNTP2μl，Taq酶0.5μl，去离子水补足30μl。94℃预变性5min，94℃变性50s，55℃复性50s，72℃延伸60s，循环30次，

7、72℃末端延伸5min。1.6PCR扩增产物的纯化使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，用德国Qiagen公司胶回收试剂盒回收纯化。1.7SOD2基因的克隆PCR产物纯化后与pGEMT载体（购自Promega公司）连接。按照常规氯化钙法转化JM109（为本室保存），蓝白筛选出阳性菌落,并进行PCR扩增鉴定,转板培养。1.8SOD2重组克隆的序列测定将提取的质粒用双脱氧终止法PCR扩增并进行扩增产物的纯化，向反应体系中加入75％异丙醇80μl沉淀DNA，室温放置15m