生物工艺学第2章--基因工程工具酶1.ppt

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1、基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DN聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。基因工程工具酶自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。基因工程工具酶基因工程工具酶及其应用限制性核酸内切酶—

2、主要用于DNA分子的特异切割DNA连接酶—用于DNA和RNA的连接DNA聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)限制性内切酶的发现限制性内切酶的分类限制性内切酶的命名限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的切割特点限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的应用一.限制性内切酶的概念核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exo

3、nuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。限制性核酸内切酶的发现细菌的限制—修饰作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle发现细菌的限制（restriction）现象：Phageλ（k）E.colikE.coliB【E.coliB限制λ（k）】感染不感染噬菌体侵染细菌噬菌体侵染细菌仍有少量phageλ(K)可在E.coliB中生存，是因为E.coliBphage对λ(K)进行了修饰。大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)修

4、饰的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修饰作用）R-M系统细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。限制性内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现1968Linn和Arber从E.coliB中发现限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血杆

5、菌发现限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的活性单位50μLBuffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位

6、，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巯基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫苏糖醇BSA：牛血清蛋白)限制性核酸内切酶的切割特点在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单链延伸末端。识别序列绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。

7、识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。ABCC’B’A’A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’ABB’A’ABB’A’或或EcoRⅠ5‘……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’不同核酸内切酶的特异识别位点PstⅠ5’……CTGCAG……3’3’……GACGTC...…5’AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用三、种酶