2011～2012年嘉兴市乙型流感病毒监测和ha1基因特性研究

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1、2011～2012年嘉兴市乙型流感病毒监测和HA1基因特性研究　　[摘要]目的：了解2011～2012年嘉兴市乙型流感病毒的流行及HA1基因特性、变异特点及WHO推荐流感疫苗株对人体的保护情况。方法：将采集的流感样病例的咽拭子标本用MDCK细胞培养分离流感病毒，用标准血清及荧光定量RT-PCR方法鉴定。随机选取6株乙型流感进行HA1基因核苷酸序列测定，并进行特性分析。结果：2011～2012年嘉兴乙型流感Victoria系和Yamagata系同时存在。随机抽取4株Victoria系和2株Yamagata系毒株，在糖基化位点上没有变化。4株Victoria系毒株核苷酸同源性为98.6～99

2、.7%，氨基酸同源性为98.8～100.0%，其中2株与2009～2012年疫苗株相比，在L58P、N129S、I146V、N171D发生了氨基酸的替换；2株Yamagata系毒株核苷酸和氨基酸同源性为99.4%，与2012～2013年疫苗株极为接近。结论：嘉兴市流行的Victoria系乙型流感病毒与2009～2012年疫苗代表株同源性较高，当年度的流感疫苗株对本市Victoria系乙型流感病毒流行的防治有一定保护作用。但本地同时也还活跃着Yamagata系的乙型流感病毒，当年度的流感疫苗株对Yamagata系乙型流感病毒不能提供最佳保护。[关键词]9乙型流感病毒；血凝素基因；核苷酸序列

3、；Yamagata系；Victoria系流感病毒属于正粘病毒科，其基因组为分节段负链RNA，分为甲、乙、丙3种型别，均可感染人。甲型流感病毒由于其传播速度快，感染性强，且抗原容易变异，所以容易造成局部爆发，甚至是世界大流行。乙型流感病毒常常引起局部流感爆发。流感病毒血凝素抗原（HA1）是其主要抗原之一，是流感病毒发生抗原性变异的分子基础。根据嘉兴市近几年的流感监测情况发现，乙型流感病毒也是相当活跃的，所以非常有必要了解嘉兴市乙型流感病毒基因的变异情况和WHO推荐流感疫苗株对人体的保护情况。因此，我们对采集的流感样病例的样本进行流感病毒的核酸监测，并进行病毒分离和鉴定，随机抽取了2011～

4、2012年共6株分离到的乙型流感病毒，对毒株的血凝素HA1基因进行了序列测定及分析。1材料与方法标本来源采自本地区的国家级流感哨点监测医院（嘉兴市第一医院），按照流感样病例的定义，采集发病3天内且未服用过抗病毒药物的流感样病例的鼻咽拭子和含漱液标本，24h内专人运送至本中心流感网络实验室。1.2荧光定量RT-PCR试剂和仪器标本进行荧光定量RT-PCR检测，荧光定量PCR仪为美国ABI公司的ABI7500。病毒核酸提取试剂为AMBIONINC9（THERNACOMPANY）试剂盒，引物探针由浙江省疾病预防控制中心提供，Real-timePCR试剂盒：TaKaRa试剂盒，宝生物工程（大连）

5、有限公司生产。1.3细胞培养与试剂狗肾传代细胞（MDCK）由浙江省疾病预防控制中心提供，本实验室传至适宜代数用于病毒分离。DMEM、胎牛血清等组织细胞培养试剂均为GIBCO公司产品。1.4病毒分离及鉴定参照《全国流感监测方案（2010版）》、WS285-2008《流行性感冒诊断标准》等要求进行病毒分离。观察细胞病变（CPE）并测定血凝素（HA），阳性分离物即为流感病毒分离株，保存于-70℃低温冰箱并用流感标准抗血清进行血凝抑制试验（HI），鉴定型别。流感标准抗原与抗血清由中国疾病预防控制中心国家流感中心提供。1.5病毒核糖核酸的提取随机抽取2011～2012年本实验室从流感样病例标本中分

6、离到并经标准抗血清鉴定为乙型流感病毒的流行代表株共6株，采用德国Qiagen公司的RneasyMiniKit试剂盒提取毒株RNA。1.6RT-PCR反应和HA1基因序列测定1.7序列测定和数据分析92011～2012年共分离到血凝效价>1：8的乙型流感毒株共12株。在分离到乙型流感病毒的月份中，2011年1～4月初分离到的乙型流感均为Yamagata系，共3株。2011年4月中旬～5月和2012年1～4月分离到的乙型流感均为Victoria系，共9株。均采用HI试验鉴定亚型。2.4HA1基因进化分析2.5HA1基因的同源性分析2.6HA1基因的序列分析讨论乙型流感病毒的感染过程是由病毒表

7、面HA蛋白结合到宿主细胞表面的唾液酸受体，从而引起人类呼吸系统疾病，根据HA基因核苷酸序列的差异，乙型流感病毒被分为两个系，Victoria系和Yamagata系，两个系之间的抗原不存在交叉免疫反应[1]。分析嘉兴市6株乙型流感的HA1基因序列，2株Yamagata系毒株HA1区氨基酸序列长度为346个，与代表株B/Yamagata/16/1988比较在165位上都有一个天冬酰胺（N）；4株Victoria系毒株HA1区氨基酸序列长