马流感病毒青海株相关特性研究及其基因组分析

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1、东北农业大学博士学位论文马流感病毒青海株相关特性研究及其基因组分析姓名：杨建德申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：李景鹏2003.5.1摘要马流行性感冒(Equineinfluenza，E1)，是危害养马业和赛马业的一种十分重要的接触性呼吸道传染病，主要表现咳嗽、喷嚏、发热、食欲减退，怀孕母马可发生流产症状。EI的病原为正粘病毒科A型流感病毒属的马流感病毒(EquineInfluenzaVirus，EIV)，EIV与同属的禽流感、人流感和猪流感病毒关系较为密切。EIV基因组全长约为13．6kb，包括有8个基因片段，分别为聚合酶(PB2、PBl、PA)基

2、因、血凝素(HA)基因、神经氨酸酶(NA)基因、核蛋白(NP)基因、基质蛋白(M)基因和非结构蛋白(NS)基因，编码lO种蛋白。过去，在我国曾发生过三次规模较大的马流感流行。1994年，从青海省暴发马流感的病马中分离出一株EIV，命名为A／Equine／Oinghai／1／94。为了弄清流行于我国马群中EIV的来源及遗传学背景，并为进一步研制有效疫苗提供科学依据．本研究着重进行了EIv，青海株(A／Equine／Qinghai／1／94)相关特性研究及其基因组分析。、／将EIV青海株在SPF鸡胚中连续传7～8代后，病毒的血凝滴度趋于稳定，可达到l：5l争以上，

3、电镜下观察具有典型的正粘病毒粒子形态，病毒粒子大多是球形，有囊膜，个别为丝状，平均直径lOOim。血凝活性的温度敏感性试验结果表明．73℃以上作用10分钟和7l℃以上作用30分钟，血凝活性丧失。对EIV青海株进行的实验动物感染试验证实，经滴鼻和肺脏接种双重途径可在小鼠、大鼠、豚鼠和兔体内产生EIVHI抗体．仅在小鼠产生可见的精神萎靡、发抖、呼吸困难等症状，没有观察到有死亡现象。剖检可见发病小鼠肺脏充血、淤血、肿大，从其肺脏分离出有血凝活性的病毒，电镜观察为典型的正粘病毒形态；在大鼠、豚鼠和兔来观察到明显的临床症状及病理学变化，也未分离出病毒：抗体水平监测结果显

4、示，在兔体内产生的EIVHI抗体水平明显要高于小鼠、大鼠和豚鼠的抗体水平。HA是EIV最重要的结构蛋白和免疫保护性抗原，其基因在基因组中变异频率也最高。为了明确我国EIV之间的亲缘关系、EIV与禽流感病毒的关系及我国EIV在世界EIV中的地位，本研究克隆了国内3株EIVHA基固，测序后，构建了我国EIV与一些禽源和马源流感病毒HA基因进化树。通过}lA基因序列比较分析发现，我国A／Equine／0inghai／1／94株和1992年香港分离出的2株EIV关系密切．核苷酸同源率可达95％．这3株病毒均属于国际上典型的H3N8亚型EIV：而我国A／Equine／J

5、ilin／1／89及A／Equine／HeJlongJiang／1／89株与A／Equine／Qin曲ai／1／94株的同源率均为82．6％，通过进化树分析发现，这2株病毒均来源于禽。用10日龄SPF鸡胚繁殖青海株ElY，从接种该毒株的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组RNA，根据genebank中已发表的相应核苷酸序列设计并合成针对各基因的特异性引物，通过反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增8个基园片段的cDNA，扩增的PCR产物经胶回收纯化后，克隆到pG酬．T—easy载体上，重组质粒经酶切鉴定后进行序列测定。序列测定正确后．通过计算机软件对其进行分析，并与

6、国内外参考毒株进行比较．结果发现，克隆的A／Equine／Qinghai／1／94HA基因1738bp，编码575个氨基酸(AA)；NA基因1450bp，编码484个AA：NP基因1554bp，编码515个AA：M基因978bp，编码326个AA：NS基因813bp，编码226个从：PB2、PBl和PA基因分别为233Ibp、2332bp、2224bp，编码774、775、740个AA。通过构建各基因进化树及序列比较分析发现，ElY青海株的各基因在核苷酸和氨基酸水平上与欧洲的EIV参考毒株关系最为密切．因此推断，我国A／Equine／Qinghai／1／94毒

7、株可能来源于欧洲。根据}IA基因阅读框架和pcDNAS．0的酶切序列设计一对引物，上游引物舍有HindIII东北农业大学农学博士学位论文!Im●皇■●鼻—

8、——曼—喜—■量—置—量——目——■E—■置——●皇—皇—■■—曹■皇奠詈■置鼍—舅—曼●暑宣置量

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10、皇■寞—鼍酶切位点和Kozak翻译起始序列，下游引物含有Bali酶切位点。通过PCR反应，从pGI瑚-HA扩增出带有Kozak翻译超始序列和酶切位点的IIA基因，并将该基因与pcl)NA5．0经HindIII、Bali酶切，胶回收纯化后连接。经过酶切鉴定和核苷酸序列测定分析，本试验成功地构建了真核

11、表达质粒pcDNA-flA。综上所述，