基于假病毒系统三株流感病毒膜蛋白ha%2fna重配特性的研究

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1、温州医学院硕士研究生学位论文基于假病毒系统的三株流感病毒膜蛋白HA／NA中文摘要重配特性的研究目的本试验在逆转录病毒载体基础上，采用构建的流感病毒假病毒颗粒，进行研究流感病毒不同株型之间膜蛋白I--IA／NA重配的特性，为新型流感病毒的预防与抗体研制提供科学的理论依据。方法1．三组HA／NA氨基酸序列的比对我们通过人工方法对三组HA／NA氨基酸序列进行了对比，以H3N2HA和H3N2NA为模板进行比对，AHH5N1HA／NA和2009H1N1HA／NA中与之相同的氨基酸序列以“．"代替，并对比对序列做以标记。2．质粒构建通过酶切、PCR等方法从原始质粒上获取不同株型的流感病毒膜蛋白HAs／NA

2、s的eDNA片段，然后将获得的不同eDNA片段克隆至pVRC表达载体形成表达质粒(pCMV-HA／NAexpressionplasmid)。3．流感假病毒颗粒的制作假病毒颗粒的制作是将pVRC-HA／NA表达质粒，Gag．Pol包装质粒(Gag．polexpressionplasmid)和EGGP报告质粒(Reporterexpressionplasmid)三种质粒共转染至293T细胞内，72小时后从上清中收取假病毒颗粒(pseudotypedparticle．PP)。4．假病毒颗粒表达量的评价于转染后293T细胞上清中收取假病毒颗粒，用qPCR定量不同重配的假病毒颗粒的拷贝数。5．假病毒颗粒

3、感染力的评价过滤的pps按qPCR定量结果将不同假病毒颗粒调整至同一拷贝数水平后进行感染试验，感染72小时后胰酶消化悬浮后通过流式细胞仪点取GFP表达的A549细胞数量用于假病毒颗粒感染力的评价。6．假病毒颗粒血凝试验将九种pps根据qPCR结果调整至同一拷贝数水平进行血凝试验。温州医学院硕士研究生学位论文7．不同流感假病毒颗粒HA／NA蛋白表达的评价评价上清中假病毒颗粒中HA／NA的表达情况，取同量未调整的样品加入4×LDS上样缓冲液水煮5分钟后跑SDS．PAGE胶，电转至PVDF膜上显色观察。结果1．三组HA／NA氨基酸序列的对比在HA的586个氨基酸序列中，2009H1N1HA有325(

4、55．46％)个氨基酸序列不同，AHH5N1HA有328(55．97％)个氨基酸序列不同。2009H1N1HA、H3N2HA、AHH5N1HA三株HA的氨基酸序列中糖基化位点数分别为6、12、9个，在190、194、226处H3N2HA的氨基酸不同于其余两株，分别被D、I和Q替代。在NA的480人氨基酸序列中，2009H1N1NA和AHH5N1NA分别有260(54．28％)、248(51．77％)个序列不同。H3N2NA、2009HINlNA和AHH5N1NA分别含有8、6、3个糖基化位点，在151序列处H3N2NA的氨基酸被D替代。2．qPCR结果在转染条件一致的情况下，带有AHH5N1H

5、A的pps在同样时间内分泌的假病毒颗粒拷贝数明显多于带有H3N2HA和2009H1N1HA的pps。其中带有H3N2HA的pps分泌最少。3．血凝结果带有AHH5N1HA和2009HINlHA的pps血凝大致相同，而带有H3N2HA的pps滴度未测出。4．九种pp感染力根据qPCR结果调整至同一拷贝数水平后的九种pps感染力：其中带有AHH5N1HA的pps感染力明显高于带有H3N2HA和2009H1N1HA的pps。其中带有H3N2HA的pps感染力最低。5．pps中HA／NA蛋白表达评测结果在pps中的HA表达中，2009H1N1HA与AHH5N1HA在分子量和糖基化类型上与各自对应的灭活

6、真病毒十分相似。而在H3组合中，假病毒颗粒的糖基化明显不同于灭活真病毒(H3N2(W))，并且H3N2HA的分子量明显大于2009H1N1HA和AHH5N1HA，在138KD和66KD之间，灭活真病毒要比假病毒多出一条带。在所有假病毒中可以看到HA0都有明显的表达，而在AHHSNlHA组合中，HA0的活化类型明显多于其余两种HA。在pps中的NA表达中，H3N2NA2009H1N1NA与AHH5N1NA在分子量的大小和类型上有明显的不同，H3N2NA主要表达为四聚体，三聚体和单聚体，2009H1N1NA主要表达为单聚体和三聚体，而AHHSNlNA却主要表达为单聚体。2温州医学院硕：t研究生学位

7、论文结论运用假病毒颗粒技术平台，可以在不同株型(亚型)的流感病毒间重新排列重配可以产生具有感染力的新病毒株。在假病毒颗粒和野生型病毒的HAs中表达量最高的是前体HA0。NAs中H3N2NA主要表达为四聚体，2009H1N1NA主要表达为二聚体，而AHH5N1NA主要为单聚体。四聚体，二聚体和单体NAs都具有生物学功能，都可以在病毒生命周期中发挥作用。在重配实验中，AHH5N1HA可以与其它NAs重