猪流感病毒和“猪禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究

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1、华中农业大学硕士毕业论文摘要猪流感(SwineInfluenza，SI)是由猪流感病毒(SwineInfluenzaVirus，SIV)引起猪的一种急性、高度接触性的呼吸道传染病。SIV不仅可感染猪，同时也具有感染禽等鸟类和人、马等其他哺乳动物的能力。而猪可被禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus，AIV)和人流感病毒感染，是流感病毒基因重组或重配的“混合器”和流感病毒新流行毒株产生的“孵育器"，因而猪是流感病毒“禽．哺乳动物”种间传播链中重要的中间宿主。SIV及猪的这些特征决定了它们在流感病毒种间传播中具有

2、不可替代的地位，SW在流感病毒的流行、跨种传播等方面的研究以及在公共卫生上都具有重要意义。本研究利用流感病毒8质粒拯救系统成功拯救了一株猪流感病毒以及两株“猪．禽"流感重配病毒，并比较两株重配病毒与其亲本毒之间的毒力差异。这为研究评估“猪．禽”流感重配病毒的风险以及流感病毒跨种传播提供了一定依据。主要研究结果如下：1．H1N1亚型猪流感病毒的拯救利用流感病毒8质粒拯救系统成功拯救出了猪流感病毒毒株A／Swine／TianJin／01／2004(H1N1)(a／s／TJ／04)。将猪流感病毒8个基因节段经RT-PCR合成c

3、DNA后，分别克隆到RNA聚合酶HI双向表达载体pHW2000中，构建成8个重组质粒。用8个重组质粒共转染COS．1细胞，30小时后加入TPCK．胰酶至终浓度0．5}tg／mL。共转染48～72h后收获COS．1细胞及其上清，经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚。收获死亡鸡胚尿囊液并继续用SPF鸡胚传3代，得到有感染性的病毒。经血凝、血凝抑制试验、测序分析、电镜观察等均证实了～S册／04猪流感病毒的成功拯救，这为进一步研究猪流感病毒基因组结构与功能的关系、流感跨种传播的机制以及构建新型猪流感疫苗株奠定了基础。2．“猪一禽’’流感

4、重配病毒的拯救及其生物学特性的研究以流感病毒8质粒拯救系统为工具，分别将猪流感病毒毒株A／S厂rJ／04的HA基因以及HA和NA基因用禽流感病毒A／chicken／Hubei／327／2004(H5N1)(A／C／HB／04)的相应基因片段进行置换，构建了“7+1"型重配病毒T+H(HA)和“6+2’’型重配病毒T+H(HA／NA)，并测定亲本毒和重配毒的EID50。以BALB／e小鼠为动物实验模型，各种病毒以106EID50的病毒量对小鼠进行攻毒，观察小鼠的存活率和体重变化情况，并在攻读后第3、6、12天取小鼠心、肺、

5、脾、直肠和脑，计算组织体重比(即比重)，利用抗原捕捉ELISA检测方法检测各器官的病毒含量。通过对各攻毒组的数据进行比较，比较亲本毒株和重配毒株对小鼠感染致病能力的差异。结果显示，重配毒株对小鼠的致病力介于两亲本毒之间，强于猪流感病毒A／S／TJ／04而弱于禽流感病毒A／C／HB／04，其中重配毒株T+H(HA／NA)的致病力又强于T+H(HA)。结果表明猪流感病毒A／S／TJ／04在获得禽流感病毒A／C／HB／04的HA或HA和NA基因后致猪流感病毒和“猪-禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究病力和组织嗜性都有所

6、增强，在跨种传播和病毒流行方面具有一定的风险性，但同时也具有一定的限制性。关键词：猪流感病毒；拯救；共转染；禽流感病毒；重配病毒；致病力；跨种传播。4华中农业大学硕士毕业论文TheRescueofSwineInfluenzaVirusand“Swine．Fowl’’InfluenzaReassortmentVirusandtheReseachofBiologicPropertyAbstractSwineinfluenza(SI)iScausedbyswineinfluenzavirus(SIV)，anditCallind

7、uceanacutezymoticdiseaseofrespiratorytract．SⅣCallnotonlyinfectspig，butalthoughfowlandothermammalsuchasthehumanbeingandhorse．AndpigCanbeinfectedbyavianinfluenzavirus(AIV)andHumaninfluenzavirus，it’Sthemixingmillforrecombinationandreassortmentofinfluenzavirusgenesan

8、dthecouveusefortheformingofnewpopularinfluenzavims，astheimportantintermediaryhostfortheinterspeciestransmissionofinfluenzavirusbetweenfowlandmammal．nlefeatureo