多基因遗传修饰猪体外抑制猪流感病毒增殖的初步分析

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密级:论文编号:中国农业科学院学位论文多基因遗传修饰猪体外抑制猪流感病毒增殖的初步分析SupressionofSwineInfluenzaVirusProliferationinvitroofPolygeneGeneticallyModifiedPorcine硕士研宄生：臧凤霞指导教师：孟庆文副研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：哈尔滨兽医研究所中国农业科学院研究生院2015年5月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:武良时间：年5月沾日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被査阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文•同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容*研究生签名时间：缚年j：月d曰导师签名：如大时间：年JT月沾曰 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目多基因遗传修饰猪体外抑制猪流感病毐增殖的初歩分析啓医微生物及其论文作者臧凤霞专业兽医专业研宄方向分子生物物学中国农业科学脘哈尔滨兽医指导教师孟庆文培养单位（研究所)研究所.姓名职称硕单位专业鍫名评-顿导口刘云教授东北农业大学博导0阅硕导口黄显会教授华南农业大学兽医药理人博导E1答辩主席重大疾病基硕导□吴英杰教授大连医科大学因工程換式博导E动物硕导□王靖宇大连医科大学实验动物学博导a硕导□仇华吉研究员哈尔滨&医研宄所预防倍医学博导a答硕导B贾洪林副研究员哈尔滨#医研究所预防啓医学f叫博导口辩硕导0韩凌霞副研究员哈尔滨兽医研究所预防兽医学博导口委硕导口博导口员硕导口博导口硕导口博导口会议记录（秘书）赵丽丽论文答辩时间地点2015年5月26日哈尔沆兽医研究所学术报告厅 密级：论文编号：中国农业科学院学位论文多基因遗传修饰猪体外抑制猪流感病毒增殖的初步分析SupressionofSwineInfluenzaVirusProliferationinvitroofPolygeneGeneticallyModifiedPorcine硕士研究生：臧凤霞指导教师：孟庆文副研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：哈尔滨兽医研究所中国农业科学院研究生院2015年5月 Secrecy：No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationSupressionofSwineInfluenzaVirusProliferationinvitroofPolygeneGeneticallyModifiedPorcineM.S.Candidate：ZangFengxiaSupervisor：AssociateProf.MengQingwenDegree：MasterofAgriculturalExtensionSpecialty：VeterinarymicrobiologyandmolecularbiologyApril2015 摘要猪流感（Swineinfluenza，SI）是由猪流感病毒（Swineinfluenzavirus，SIV）引起的一种急性、高度接触性的群发性呼吸道传染病，能够造成猪群免疫抑制，给养猪业带来重大危害，同时会给人类健康构成威胁，具有重要的公共卫生意义。RNA干扰(RNAinierference，RNAi)是在进化过程中高度保守、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的高效特异性地降解同源mRNA的现象，能特异抑制病毒基因的表达；Mx蛋白是I型(α/β)和III型(λ)干扰素(IFN)诱导产生的细胞自身天然抗病毒活性的关键效应分子，是一种广谱的抗病毒蛋白。现代养猪生产，生产性状与抗性性状之间存在一定程度的遗传拮抗，单纯追求高产目标通常导致猪抵抗力降低；通过转基因技术改造猪的遗传性状，提高机体免疫力，可能是控制传染性疾病的有效手段。本实验室前期筛选出RNAi、Mx和4shRNA三个基因，并在细胞水平或小鼠体内或者静脉猪体内证实证明三个基因具有抗病价值。在此基础上本研究探索将这三个基因联合构建到慢病毒载体中，包装慢病毒后感染猪胎儿成纤维细胞制备核供体细胞，通过体细胞核移植技术成功获得F0代克隆猪。运用分子生物学方法PCR、Southernblot、RT-PCR、Westernblot分别在DNA、RNA、蛋白质水平对F0代猪进行鉴定分析，结果表明，3头F0代克隆猪均为阳性转基因猪；选取其中一头与同品种野生型猪（WT）进行杂交，繁育F1代转基因猪。利用上述分子生物学方法对F1代转基因猪进行分析，结果表明4头F1代转基因猪中1头有外源基因的整合和表达，为阳性转基因猪。证明表达4shRNA-Mx-RNAi多基因转基因猪转入的外源基因能够稳定遗传至F1代。为进一步探究F1代转基因猪成纤维细胞的抑制流感病毒复制效果，本研究分离培养1日龄F1代转基因猪尾组织成纤维细胞，100TCID50A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株感染后，通过间接免疫荧光（IFA）、实时荧光定量PCR（Real-timePCR）、病毒滴度测定分析了F1代转基因猪在细胞水平上抑制流感病毒复制的活性。结果表明，在攻毒后不同时间点，与非转基因猪和WT猪相比，转基因猪成纤维细胞能够抑制流感病毒增殖；感染流感病毒后各时间点，外源基因都有一定的抑制流感病毒的活性，而在16h时抑制效率达到最高，IFA结果显示转基因猪成纤维细胞对流感病毒的抑制效率高于非转基因猪和野生型猪，细胞中H1N1PB2基因复制效率比WT降低-2.82倍，细胞上清中病毒TCID50达1×10。表明表达多基因转基因猪在细胞水平上具有抑制流感病毒复制的活性。本研究成功构建了表达4shRNA-Mx-RNAi重组慢病毒载体，利用体细胞核移植技术制备了能够表达多基因抗流感转基因猪，并证实其体内有外源基因的整合与表达，能够稳定遗传至F1代，其成纤维细胞具有抑制流感病毒复制活性，为多基因协同抑制流感病毒复制研究提供了转基因猪模型，为探索新的抑制流感病毒复制策略和转基因动物抗病研究奠定基础。关键词：RNAi，Mx，多基因，猪流感，转基因猪I AbstractSwineinfluenza(SI)isanacuteandhighlycontagiousoutbreakofrespiratorydiseasecausedbytheswineinfluenzavirus(SIV)anditcancausetheswineimmunesuppression.Itbringsgreatharmtothepigindustryandposeathreattohumanhealth.RNAi(RNAinterference,RNAi)referstohighlyconservedduringevolution,bydouble-strandedRNA(doublestrandedRNA,dsRNA)inducedefficientspecificityofhomologymRNAdegradationphenomenon.StudiesconfirmthatRNAinterferencecanspecificallysuppressvirusgeneexpression;MxproteinisthecellsthemselveskeymoleculeofnaturalantiviralactivityinducedbytypeI(α/β)andtypeIII(λ)interferon(IFN),isabroad-spectrumanti-viralprotein.StudieshaveconfirmedthatMxispresentefficientresistanceforRNAvirusesandDNAviruses.Modernpigproduction,therearegeneticantagonismtosomeextentbetweenproductiontraitsandresistancetraits,thesimplepursuitofhighyieldusuallyleadstopigstoreduceresistance;Throughtransgenictechnologyreformpiggenetictraits,improveimmunity,maybeaneffectivemeanstocontrolinfectiousdiseases.OurteamhavescreenedRNAi,Mxand4shRNAwhichwereconfirmedtohaveresistancevalueatthecellularlevelorinvivoofmiceorpigs.Onthebaseofthisstudyweexploredtoconstructthe4shRNA-Mx-RNAirecombinantlentiviralvector.Packinglentivirusinfectedtheporcineembryonicfibroblaststopreparenucleardonorcells.WesuccessfullyproducedF0pigsbysomaticcellnucleartransfertechnology.UsethemethodsofmolecularbiologyPCR,Southernblot,RT-PCRandWesternblotrespectivelyinDNA,RNAandproteinlevelforF0generationswineidentification.TheresultsshowthatthethreeF0generationoftransgenicswineareallpositivetransgenicpigs;Chooseoneandthesamespeciesofwildswine(WT)hybridization,breedingF1generationoftransgenicswine.UsingtheabovemethodsofmolecularbiologyforappraisalanalysisinF1generationtransgenicswine,theresultsshowthatoneinthefourheadF1generationoftransgenicswinehavetheintegrationandexpressioninexogenousgenes,positivefortransgenicswine.ProvethatexogenousgeneintheRNAi-Mx-shRNAmultiplegenesexpressiontransgenicpigscanbestablyinheritedtotheF1generation.InordertofurtherexploretheeffectofinhibitingviralreplicationinF1generationoftransgenicpigsfibroblasts,isolationandcultureone-day-oldF1generationoftransgenicpigstailtissuefibroblasts,after100TCID50A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)straininfection,byindirectimmunofluorescence(IFA),real-timequantitativePCR(Real-timePCR),viraltiteranalysisofF1transgenicpigcellsinhibittheactivityofinfluenzavirusreplication.Resultsshowthatatdifferenttimepointsafterpost-infection,comparedwithnon-transgenicpigsandWTpigs,transgenicpigfibroblastscaninhibittheproliferationofinfluenzavirus;AteachtimepointafterInfluenzavirusinfection,theexogenousgenehascertaininhibitoryactivityofinfluenzavirus,andtheinhibitionefficiencyreachedthehighestin16h,IFAresultsshowthatthetransgenicpigsfibroblastsontheinhibitionefficiencyofinfluenzavirusishigherthanthenontransgenicpigsandWTpigs.CellsH1N1PB2genereplicationefficiencyisreducedby2-2.8timesthanthatofWT,cellsupernatantvirusTCID50upto1×10.Showthatmultiplegenesexpressiontransgenicpigsatthecellularleveltoinhibittheactivityofinfluenzavirusreplication.Thisstudysuccessfullyconstructedthe4shRNA-Mx-RNAirecombinantlentiviralvectorandproductedthetransgenicpigswhichcanresistinfluenzavirusbysomaticcellnucleartransfertechnology.Andconfirmedthatthetransgenicpigshaveintegrationandexpressioninexogenousgene,whichcanstablyinheritedtotheF1generation,itsfibroblastswithinhibitionactivityofinfluenzavirusII replication,forpolygenicsynergisticinhibitioninfluenzavirusreplicationstudyprovidingatransgenicpigmodel,forexplorenewinhibitioninfluenzavirusreplicationstrategyandthestudyoftransgenicanimaldiseaseresistancetolaythefoundation.Keywords：RNAi;Mx;Multiplegenes;SIV;TransgenicpigIII 目录第一章引言.....................................................................................................................11.1RNA干扰技术研究进展.........................................................................................11.1.1RNA干扰.......................................................................................................11.1.2RNAi作用机制..............................................................................................11.1.3RNAi技术抑制病毒复制研究......................................................................21.2Mx基因及其蛋白研究进展....................................................................................31.2.1Mx基因的发现及其结构..............................................................................31.2.2不同种属动物的Mx蛋白............................................................................31.2.3Mx蛋白的抑制病毒复制研究......................................................................41.2.4展望...............................................................................................................41.3转基因猪研究进展.................................................................................................51.3.1转基因动物制备方法....................................................................................51.3.2转基因猪的应用研究...................................................................................61.3.3展望...............................................................................................................7第二章表达多基因转基因猪的制备与遗产稳定性研究...............................................92.1.1实验材料.......................................................................................................92.1.2主要实验仪器.............................................................................................102.1.3主要试剂.....................................................................................................102.1.4试剂配制.....................................................................................................102.1.5引物设计及合成.........................................................................................102.1.6转基因猪的制备.........................................................................................112.1.7F0代转基因猪鉴定.....................................................................................122.1.8F1代转基因猪鉴定.....................................................................................152.2结果.......................................................................................................................162.2.1转基因猪的制备.........................................................................................16IV 2.2.2F0代转基因猪的转基因整合分析.............................................................182.2.3F0代转基因猪的转基因表达分析.............................................................192.2.4F0代转基因猪的转基因拷贝数检测.........................................................212.2.5整合位点分析与验证.................................................................................222.2.6F1代转基因猪的转基因整合分析.............................................................242.2.7F1代转基因猪的转基因表达分析.............................................................252.3讨论........................................................................................................................26第三章细胞水平研究转基因猪抑制流感病毒活性.......................................................283.1材料与方法...........................................................................................................283.1.1实验动物与细胞.........................................................................................283.1.2病毒与载体.................................................................................................283.1.3主要实验仪器...........................................................................................293.1.4主要试剂.....................................................................................................293.1.5引物设计及合成.........................................................................................293.1.6流感病毒毒力测定.....................................................................................293.1.7F1代转基因猪尾成纤维细胞分离培养.....................................................293.1.8流感病毒感染猪成纤维细胞.....................................................................303.1.9间接免疫荧光检测转基因猪成纤维细胞抑制流感病毒增值.................303.1.10实时荧光定量PCR检测流感病毒PB2基因mRNA含量...................303.1.11细胞上清中流感病毒滴度测定...............................................................313.1.12数据统计...................................................................................................313.2结果.......................................................................................................................313.2.1流感病毒TCID50测定结果.......................................................................313.2.2猪尾成纤维细胞的分离培养.....................................................................313.2.3间接免疫荧光检测结果.............................................................................323.2.4荧光定量PCR检测流感病毒PB2基因mRNA含量结果.....................32V 3.2.5细胞上清病毒滴度测定结果.....................................................................333.3讨论.......................................................................................................................33第四章全文结论.............................................................................................................36参考文献.............................................................................................................................37致谢.................................................................................................................................44作者简历.............................................................................................................................45VI 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称RNAiRNAinferenceRNA干扰MxMyxovirusresistancegene抗粘液病毒基因dsRNAdouble-strandedRNA双链RNARISCRNAinducedsilencingcomplexRNA诱导沉默复合体shRNAshorthairpinRNA短发夹RNAMDCKMadinDarbycaninekidneycells狗肾细胞PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应qRT-PCRquantitativereversetranscriptasePCR定量反转录聚合酶链式反应siRNAsmallinterferingRNA小干扰核糖核酸DMEMDulbecco’sMinimumEagleMediumDMEM培养基FBSFetalBovineSerum胎牛血清SIVSwineInfluenzaVirus猪流感病毒TCID5050%TissueInfectedDose半数组织培养感染量TGTransgenic转基因NO-TGNo-transgenic非转基因WTWild-type野生型HAHemagglutinin血凝HIHemagglutininInhibition血凝抑制rpmrotationperminute每分钟转速bpbasepair碱基对LBluria-bertanimediumLB培养基gmicrogram微克mgmilligram毫克mLmilliliter毫升VII 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1RNA干扰技术研究进展1.1.1RNA干扰RNA干扰是生物在进化过程中，高效特异性地由双链RNA诱发产生的降解同源mRNA现象。RNA干扰能使某个或多个病毒基因保持在休眠状态而不表达，识别的基因序列可以精确到一个碱基，是一种能够抑制病毒复制的有效策略。1998年，Fire和Mello将纯化的dsRNA注射到秀丽线虫体腔，发现与单独注射基因正反义链的线虫相比，注射了dsRNA线虫的unc22基因表达量显著降低，表明dsRNA能够沉默unc22基因的表达；在其他线虫体内注射基因的dsRNA也取得了同样的高度特异性效果（Fireetal.，1998），因此他们将这种现象称为RNA干扰现象。在后来的研究中都证实了生物界的真核生物中普遍存在RNAi现象，也证实RNAi是一种机体防御机制，可以抵抗机体内存在的某些缺陷或者微生物的感染（Zamoreetal.，2002）。1.1.2RNAi作用机制在细胞内形成RNAi必须有dsRNA，而目前的研究表明dsRNA可以通过多种途径在细胞内产生，如通过喂养简单生物体表达dsRNA的工程菌或者转染表达dsRNA的表达载体，细胞感染病毒后，病毒RNA复制过程中间体也可形成（李江南，2011）。根据目前的研究来，RNAi的作用机制可以概括为以下几个方面：通过外源导入、转基因或病毒感染等方式转入dsRNA，RNaseIII活性的内切核酸酶将其切割成21~23nt的、由正、反义链组成的干扰性小dsRNA，即siRNA（Lipardietal.，2001）；细胞内各种特异性核酸酶与siRNA结合成复合体，即RNA诱导沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)。siRNA引导反义链与靶mRNA结合后，Dicer酶将目的mRNA序列切割，使其沉默（DzitoyevaSetal.，2001）。由于在哺乳动物中siRNA不能复制，大于30个核苷酸的dsRNA动物细胞中会导致mRNA非特异性的降解，在动物疾病的基因治疗方面这是一大障碍；因此，通过转染siRNA介导RNAi现象会受到限制。为克服这一障碍，可应用2种技术：①将人工合成、长度为19bp、且3’末端具有2个突出碱基的siRNA直接转染到动物细胞；②利用表达质粒或病毒载体在动物细胞内表达shRNA。但是化学合成siRNA在细胞内引起干扰效应时间很短暂，而将shRNA表达盒插入到宿主细胞基因组中，能达到稳定持久的基因沉默。利用shRNA表达盒制备表达shRNA的转基因动物，达到抗病目的。现在已成功制备了能稳定表达shRNA的转基因小鼠（陈志宝，2011）、大鼠（Heroldetal.，2008）、猪（Ramsoondaretal.，2009）、羊（Huetal.，2013）等。-4-8病毒基因组在复制过程中突变率高，其中RNA病毒和DNA病毒的突变率分别为10和10。病毒能够通过变异失去对RNAi的敏感性，特别是RNA病毒。所以需要用独特的策略抑制其复制某些类型的病毒。目前采用的方法是靶向病毒基因组多个位点或不同复制阶段的病毒RNA序1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言列设计siRNAs，然后进行RNAi组合的方法。即利用一个质粒载体里面包含多个shRNA表达盒，这些表达盒由不同或相同的启动子调控（Lambethetal.，2010；Songetal.，2008）。部分研究者参照miRNA的结构设计siRNAs连接方式（Mcbrideetal.，2008），因为多顺反子的miRNA转录可以起到对病毒的复合抑制作用（Aagagrdetal.，2008；Berkhoutetal.，2011）；也有一些研究者通过改变正义链中碱基来提高siRNAs的表达水平并降低其毒性(Liuetal.，2009；Saaymanetal.，2010)，均取得了很好效果，为RNAi技术在基因治疗领域的研究和应用奠定了基础。1.1.3RNAi技术抑制病毒复制研究RNAi技术可以沉默病毒复制过程中所需基因和某些辅助因子，所以利用这一技术进行病毒病的防控，是一个很好的选择，从而可以提高动物机体的免疫力，增强其抵抗病毒的能力。禽流感病毒（avianinfluenzavirus，AIV）属于A型流感病毒，可引起禽类呼吸系统和全身感染，给养禽业造成巨大损失。利用RNAi技术沉默流感病毒某些保守基因以抑制其复制，不失为一种有效的防控流感策略。Arusvk（2009）等靶向流感病毒NP和PA基因设计了以人H1启动子启动的shRNA，转染到CH-SAH细胞和MDCK细胞，结果表明shRNA能够抑制禽流感病毒的复制。2011年，Li等合成21bp的PB-shRNA，构建重组表达载体后转染MDCK细胞，发现抑制流感病毒复制效率能达到50倍，转入鸡胚和小鼠后，证实了shRNA有明显的抑制流感病毒复制的作用（Lietal.，2011)。王建超靶向流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因设计4个shRNA，分别由4个RNA聚合酶Ⅲ型启动子控制，以DNA序列的形式分别构建转录shRNA的表达盒，转染MDCK细胞，接种流感病毒后，发现其有抑制流感病毒作用（王建超，2011）。猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，CSFV）能够引起猪体的急性、热性、高度接触性传染病，对养猪业造成严重的危害。利用RNAi技术防控猪瘟的发生，不失为一种新手段。Li等构建了靶向猪瘟病毒的Npro和NS4A基因的逆转录病毒载体，筛选稳定表达siRNAPK-15细胞克隆，证实能有效抑制CSFV增殖（Lietal.，2010）。2011年，Li等以Npro、NS3和NS5B基因为靶基因，构建了单个shRNA和多个shRNA重组表达载体，分别由相同或不同的启动子调控，在细胞水平上证实了单个shRNA和多个shRNA表达载体均能抑制CSFV复制，且多个shRNA表达载体的抑制效率更强、时间更长（Lietal.，2011）。为组合RNAi方法应用于防止病毒逃逸打开了思路。口蹄疫（footandmouthdisease，FMD）目前也是能够引起猪群发病的一种重要传染病，是OIE规定的一类传染病，是由口蹄疫病毒（footandmouthdiseasevirus，FMDV）引起的高度接触性传染病。目前，灭活疫苗对偶蹄动物的保护作用有限，所以可以利用RNAi技术进行研究。Pengyan等根据FMDV保守区域3D和2B1基因设计了2个siRNA，构建重组载体后，在体内和体外分别进行接毒，结果表明2个siRNA均能抑制FMDV的复制(Pengyanetal.，2008)。Cong等靶向FDMVVP1基因不同靶点设计siRNA，构建表达质粒后转染在BHK21细胞，验证了所设计siRNA能够沉默A、O和AsiaI型VP1的表达，抑制O型和AsiaI型FDMV病毒的增殖（Congetal.，2010）。RNAi还应用于猪传染性胃肠炎、猪繁殖与呼吸综合征（Bao等，2012；Guo等，2013；Zhou等，2012）等猪传染病，均取得了较好的研究进展。在治疗病毒病过程中，siRNA靶点的病毒基2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言因变异和长期使用siRNA沉默病毒蛋白表达，导致RNAi病毒株的出现。靶向病毒基因保守序列一个或多个靶点，利用RNAi技术设计相应的siRNA或shRNA，可阻断病毒复制，进而抑制了病毒病的发生。进一步深入探讨RNAi的作用机制，研究其抗降解的能力，将为生产实践中RNAi新型生物制剂的研发奠定基础。RNAi技术出现与发展，有利于打破仅靠疫苗进行免疫预防病毒病的格局，为加快培育抗病新品种，推动畜牧业发展提供了新的策略（Gokhan，2014）。1.2Mx基因及其蛋白研究进展1.2.1Mx基因的发现及其结构Mx蛋白是I型(α/β)和III型(λ)干扰素(IFN)诱导产生的具有细胞自身天然抗病毒活性的关键效应分子，是指示I型干扰素及其受体相互关系的标记物。1962年，Lindenmann在研究近交小鼠时发现，用相同致死剂量流感病毒感染近交小鼠品系A2G小鼠和其它随机交配小白鼠，只有A2G小鼠能够耐受存活。进一步研究发现这是因为16号染色体上存在一个显性基因，能够使A2G小鼠抵抗流感病毒攻击，因此就将这一基因命名为Mx(myxovirusresistant)基因(Lindenmann，1962)。Mx1是小鼠体内主要的由IFN介导产生的胞内抗流感病毒和流感病毒样病毒的效应因子，其他种属动物的Mx基因有相似的功能，且Mx基因的表达受I型IFN（α/β）和III型IFN（γ）的严格调控（HallerOetal.，2011；Verhelsetal.，2013）。Mx蛋白是一种肌动蛋白样GTP酶，分子量在70-80KD之间。对Mx蛋白的氨基酸序列和晶体结构研究发现，其结构可分为N-未端结构域—GTP酶活性区（G），其中含有1个氨基酸序列高度保守的三联GTP序列（Vanetal.，2010）；中央活性区（MD）和C-末端结构域GTP酶效应区（GED），该区域存在的亮氨酸拉链结构与其活化和功能协调相关，能够介导Mx蛋白聚合形成二聚体或三聚体结构（Gaoetal.，2011）。但缺少GTP肌动样蛋白的PH区和脯氨酸区域（Fribourghetal.，2014）。1.2.2不同种属动物的Mx蛋白从发现Mx基因开始到现在几乎所有动物Mx基因都陆续被发现。小鼠Mx基因有Mx1和Mx2，但是只有表达于细胞核内的Mx1蛋白具有抗病毒活性（Staehelietal.，1989）。1988年，MeierE等发现了大鼠Mx基因（MeierEetal.，1988）。继发现小鼠、大鼠Mx基因后，AebiM等发现了人的Mx基因（Aebietal.，1989），即MxA和MxB，该基因位于人21号染色体长臂上，分子量为7.8万，分布于细胞浆内，其中MxA蛋白具有抗流感病毒和水泡性口炎病毒(VSV)等病毒的功能，而MxB能够抑制HIV-1等病毒复制。1992年，MullarM等发现猪细胞经IFN或双股RNA诱导后可产生大小Mx1蛋白和Mx2蛋白，Mx1蛋白有抗病毒功能，Mx2蛋白没有（Mullaretal.，1992）。马的Mx基因是1997年Chesters等从马外周血淋巴细胞中克隆得到的（Chestersetal.，1997）。之后，Ellinwood等克隆得到牛的Mxl和Mxla基因（Ellinwoodetal.，1998），分别编码654和648个氨基酸。除哺乳动物外，在禽类，Bazzhiger等于1992年首次发现了鸭Mx蛋白（Bazzhigeretal.，1992）。随后Bernasconi等从鸡胚成纤维细胞内用RT-PCR法3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言得到鸡全长的Mx基因，位于细胞质内（Bernasconietal.，1995）。与哺乳动物相比，鸟类只有一种Mx基因，而经过不断进化鱼有多种（多达7种）Mx基因（Verhelstetal.，2013）。1.2.3Mx蛋白的抑制病毒复制研究Mx蛋白具有广谱的抗病毒活性，并且不同动物种属Mx蛋白有不同的抗病毒特异性，抗病毒机理也不同，这对于人类和动物医学研究有重要意义。如人的MxA蛋白能够抑制RNA和DNA病毒的复制，但不能抑制某些其他的病毒，如HIV-1，而经过对IFN介导的抗HIV-1因子的效应因子的筛选发现，人的MxB蛋白可能有这种活性（Frickeetal.，2014）。之后的研究也阐明了人MxB蛋白能够抑制HIV-1和其他一些MxA非敏感病毒。Mx蛋白抗病毒特异性也会因为在细胞内定位的不同而不同，细胞核内Mx蛋白可以选择性地抑制在核内复制的正粘病毒如流感病毒(IV)和披膜病毒(THOV)的初始转录，而细胞质内Mx蛋白除可抑制正粘病毒的复制外，还可抑制棒状病毒、副粘病毒及布尼病毒的复制（Kaneetal.，2012）。Yi等（2011）发现将人MxA基因转入PK-15细胞和猪成纤维细胞后表达的MxA蛋白能够抑制猪瘟病毒在细胞内复制；Dan等（2014）发现猪Mx1蛋白在细胞水平也具有抑制猪瘟病毒的复制的功能；Xiao将猪Mx1蛋白与HIV-1Tat蛋白融合表达后，在细胞内证实猪Mx1蛋白能够抑制水泡性口炎病毒增殖（Xiaoetal.，2013）也有研究表明鱼类Mx蛋白有抗病毒作用，例如大西洋鲑的Mx蛋白能抑制一种被称为传染性鲑鱼贫血症病毒的流感样病毒(ISAV)，也能抑制传染性胰坏死病毒(IPNV)（Robertsenetal.，2008）。Mx蛋白最早是作为一种抗流感病毒蛋白被发现。小鼠Mx1或者加上核定位信号的人MxA可以抑制流感病毒转录，而且过表达NP和PB2可以抑制核内Mx1的抗病毒活性。表明Mx1可能和流感病毒NP或PB2形成复合物(Halleretal.，2009)。而且Mx蛋白对高致病性流感病毒，如H5N1病毒有抗病毒活性（VanHoevenetal.，2009；Manzetal.，2013）。李文超克隆了鸡Mx基因，且其631位氨基酸经序列分析为天冬氨酸，构建重组真核表达载体，转染MDCK细胞，感染禽流感病毒后在细胞水平上证实了鸡Mx基因具有抑制禽流感病毒复制的作用（李文超，2008）；Meng等（2011）发现口服重组IFN-α可诱导Mx蛋白的合成，能够抑制H9N2低致病性AIV的复制，可作为预防与治疗的药物。2011年，肖志广在细胞水平证明了鸡Mx蛋白能够抑制H5N1流感病毒的复制，且未发现鸡Mx蛋白第631位氨基酸多态性差异（肖志广，2011）。Wang的研究也证实鸡Mx蛋白631位氨基酸多态性与AIV抗性没有关联（Wangetal.，2012）。Quan等(2014)将猪Mx1基因转入猪体内制备了能够过表达Mx1基因的转基因猪，分离培养其耳尖成纤维细胞，在原代细胞水平评价了其抑制流感病毒活性，证实了猪Mx1基因具有抑制流感病毒增殖的能力。1.2.4展望Mx蛋白在细胞内的表达与病毒的感染也有关系，且对病毒反应非常敏感，在各种微生物感染机体时，只有病毒感染才会引起机体产生IFN诱导Mx蛋白的生成，因此可以根据细胞中Mx蛋白表达水平区分病毒与其他微生物感染，作为鉴别标志，从而为疾病治疗提供一定程度的指示；4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言在动物抗病育种方面，Mx蛋白可作为抗性基因，为筛选对某种病毒有抗性的动物品系提供一种新方法。如在猪体内引入具有抗高致病性流感病毒的活性Mx基因，将可改变猪的遗传性状达到抗病毒的目的，从而防止流感大流行。解析Mx蛋白晶体结构并在此基础上分析抗病毒机制，进而进行分子工程改造，将对防控新生突发病毒、尤其是人畜共患病毒具有重要非常的意义。1.3转基因猪研究进展转基因猪（Transgenicswine）是指利用基因工程技术，将已知的外源基因导入猪体内或人为改变猪基因组的一段基因序列，并能将改变的基因稳定遗传给后代。从以农业生产为目的而制备的第1批转基因猪至今已有30年的历史。从以改良猪的生产性能，到利用猪作为生物反应器来生产医用蛋白，再到作为异种器官移植供体，转基因猪研究已经涉及到人类医学、农业科学和动物医学的方方面面。1.3.1转基因动物制备方法1.3.1.1显微注射法显微注射法是在显微镜下将外源基因直接注射到受精卵原核中，体外培养受精卵数小时后移植到代孕母畜子宫中，从而获得转基因动物。Hammer等（1985）用显微注射法第一次将人的生长激素融合基因注射到猪受精卵，获得了能够表达人生长激素的转基因猪，其生长速度明显高于与其同窝非转基因猪。之后利用显微注射技术制备的各种转基因动物相继诞生。2014年Ivics等（2014）利用胞浆内显微注射技术获得了转基因猪的胚胎。1.3.1.2体细胞核移植法体细胞核移植目前应用最为广泛的转基因技术，是把整合了外源基因的细胞作为供体细胞，将其细胞核移植到其他的去核卵母细胞中，组成重构胚后移植到假孕母体中，从而获得转基因动物的一种技术。Park等于2002年利用体细胞核移植技术获得了能够表达绿色荧光蛋白EGFP的转基因仔猪（Parketal.，2002）。Lu等将目的基因构建到慢病毒载体上，将其转入35天猪胎儿成纤维细胞中，以此作为核供体，通过核移植技术获得了表达目的基因的转基因猪（Luetal.，2013）。Bao等通过体细胞核转移技术制备了3头含等位基因GGTA1基因的基因敲除仔猪(Baoetal.，2014)。1.3.1.3胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法是以胚胎干细胞作为载体，将基因导入胚胎干细胞后，将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体后与野生型动物繁育转基因动物。冯书堂等从事猪胚胎干细胞研究已多年，于2003年成功获得国内首例嵌合体猪。5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.3.1.4反转录病毒载体法主要是利用反转录病毒的DNALTR区域活性特点，将外源基因直接连接到LTR下部进行重组，包装成高滴度病毒颗粒后直接感染受精卵，或显微注到囊胚腔中。Hickey等借助嵌合体腺病毒介导的基因敲除技术（Hickeyetal.，2011）、Luo等利用重组腺病毒载体（Luoetal.，2012）、Zhang等结合慢病毒与精子载体技术（Zhangetal.，2012）都获得了基因修饰转基因猪。2013年，Sun等构建了共表达CSFVEms和E2基因重组腺病毒载体，转入猪体内后制备了可以抵御猪瘟病毒入侵的转基因猪（Sunetal.，2013）。1.3.1.5其他方法除了以上的常用制备转基因猪技术外，还有一些不太成熟而未得到广泛使用的方法，如畸胎细胞介导法、染色体片段显微注射法、受体介导法、电激法、高效微弹法等（Gokhan，2014）。1.3.2转基因猪的应用研究1.3.2.1提高抗病能力目前，养猪业普遍存在单纯追求生产目标而忽视猪体抗病能力的问题，所以，通过转基因技术可以具有抑制病毒活性的外源基因转入猪体内，从而提高猪体免疫力，增强猪群抗病能力，促进养猪业的健康、可持续发展。通过找到一些具有抵抗某种病毒的基因或者蛋白，然后将其或者编码蛋白的基因作为目的基因转入猪体内，获得能够高效表达该基因的转基因猪，从而起到抵抗病毒的作用。研究发现小鼠抗黏病毒基因Mx1编码的Mx1蛋白可有效抵抗流感病毒的感染（Staehelietal.，1991）。Muller等（1992）将Mx转入猪，获得能够表达该基因mRNA的转基因猪；Yan等（2014）通过体细胞核移植技术将猪Mx1基因转入猪体内，使其在猪体内过表达，制备了具有抑制流感病毒复制同时能抑制猪瘟病毒复制的转基因猪。在猪体内通过干扰病毒在猪体内的复制，或者干扰病毒结构基因和调节基因等特定基因的表达，也可获得具有抗病毒活性的转基因猪。2008年，吉林大学王铁东设计了靶向猪瘟病毒Npro基因和NS4A基因的siRNA，转染到猪成纤维细胞，感染猪瘟病毒后，经检测发现siRNA在细胞中高效表达，具有抑制猪瘟病毒的复制的活性（王铁东，2008）；蔡扩军等（2013）通过设计靶向O型口蹄疫病毒VP1基因shRNA，经体细胞核移植技术获得转基因猪，并在细胞水平验证了其具有抗O型口蹄疫病毒的活性；2014年，Li等针对猪繁殖障碍与呼吸系统综合征病毒（PRRSV）保守区设计shRNA，在细胞水平和动物水体证实了所获得转基因猪能够稳定遗传并具有抑制PRRSV复制的活性（Lietal.，2014）。Quan等（2014）将猪Mx1基因转入猪体内制备了能够过表达Mx1基因的转基因猪，分离培养其耳尖成纤维细胞，在原代细胞水平评价了其抑制流感病毒活性，证实了猪Mx1基因能够提供转基因猪细胞抵抗病毒的能力。1.3.2.2提高生产性能6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言应用转基因技术对猪进行生产性能改良，例如提高猪肉品质或者增快猪体的生长速度，对于提升养猪业经济增长和改善人类生活也具有重要意义。受转基因“巨型小鼠”启示，科学家们以相似的思路，利用类似方法和技术，将生长激素类基因导入猪体内以期获得出生长快且耗料低的猪品系。常被作为外源基因的生长激素类基因有MLV/pGH（Moloney氏鼠白血病毒启动子与猪生长激素重组基因）、mMT/bGH（小鼠金属硫蛋白启动子与牛生长激素重组基因）、CMV/pGH（细胞肥大病毒启动子与猪生长激素重组基因）、MLV/rGH（Moloney氏鼠白血病毒启动子与大鼠生长激素重组基因）等。陈永福与魏庆信等制备了国内第1批转OMT-PGH的转基因猪。2008年，北京畜牧兽医所研究人员将sfat1基因转入猪体内，成功制备了富含ω-3不饱和脂肪酸的转基因猪（潘登科，2011）。1.3.2.3作为人类疾病模型建立疾病动物模型有利于探索其致病机制和开发治疗药物及诊治途径，通过制备转基因猪获得的带有人类疾病的模型动物，具有遗传稳定性和来源的可重复性。作为人类疾病模型是因猪在解剖学、生理学、营养代谢等方面与人比较相似，且比传统啮齿类疾病动物模型更具有优势。Yang等（2010）以体细胞核移植制备了亨廷顿舞蹈症（Huntington'sDisease，HD）转基因猪模型；Baxa等（2013）也于2013年以慢病毒载体法成功制备了HD小型转基因疾病模型猪。Renner等（2010）以携带转基因的慢病毒注射受精胚胎，制备了表达GIPR基因（Dominant-negativeGIPR，GIPRdn）的转基因猪模型，11周龄GIPRdn转基因猪口服葡萄糖耐量降低、同时胰岛素分泌下降。1.3.2.4作为异种器官移植的供体转基因猪能够克服异种器官移植的障碍，且能防止人作为受体受到猪的病原体感染。猪与灵长类进行异种器官移植的主要障碍是识别α-1，3-半乳糖苷转移酶的抗体引起的超级免疫排斥反应（Klymiuketal.，2014）。Bongoni等制备了GGTA1杂合基因敲除/hC46/HLA-E转基因猪，探究hCD46/HLA-E在补体沉积，内皮活化，以及NK细胞相互作用中的表达的效果。将人血体外异种灌注到转基因猪四肢，导致C3b/C，C4b/c和C6累积减少和促炎性细胞粘性分子E-selectin和VCAM-1上调减少（BurdorfLetal.，2014）。这些模型可能代表异种器官移植发展战略有用的工具。RNAi对于抑制（敲除）PERV的表达是一种有前途的方法。RNAi减少PERV表达这些改进很可能在增加猪异种移植潜在的生物安全方面是有益的。为减少潜在的的危险，人畜共患病原体传播给异种移植人类患者，已经进行了广泛的研究；其中特别强调了猪内源性逆转录病毒（PERV）（Dieckhoffetal.，2008）。而RNA干扰（RNAi）对于抑制（敲除）PERV的表达是一种有前途的方法。RNAi减少PERV表达的功效已经在克隆仔猪中得到证明，通过针对PERV基因编码的衣壳蛋白，逆转录酶和包膜糖蛋白（Chuangetal.，2014；Lietal.，2013）。利用这些改进消除猪作为异种器官移植的供体所存在的生物安全问题。1.3.3展望经历了30多年的发展，在理论和技术上转基因动物的制备技术都取得了长足的进步，对生7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言物医学研究和人类福利都产生了深远的影响。合理利用转基因技术，或者与其他新技术结合应用，必将造福于人类。但是，转基因动物制备技术仍是一个艰辛复杂的系统工程，限制这一技术应用的因素包括研究病毒方法带来生物安全威胁，初代转基因动物的较低生产率以及基因随机整合和其它因素导致转基因动物的基因突变和畸形。这些因素带来的瓶颈效应在一定程度上限制了该策略与实际应用的接轨。随着科研技术手段的不断完善与深入，以上问题都将会得到解决，转基因动物技术也将获得更加广泛的应用。转基因技术对生物反应器制备、生物制药、生物材料、家畜育种等方面的发展可能会带来革命性的改变。8 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究通过RNAi技术设计靶向病毒RNA组分的siRNA，或者针对病毒感染细胞过程中所必需的辅助因子的siRNA，将其导入细胞内，利用siRNA特异性降解病毒核酸的效应从而阻断病毒的增殖过程。Hong等(2009)运用RNAi技术设计了靶向流感病毒M2基因的siRNA，在细胞水平发现siM2能够长期有效地抑制A型流感病毒的复制（Hongetal.，2009）；Roopali等（2012）靶向A型流感病毒NS1基因设计了siRNA，转入小鼠体内后，在动物水平证实其能够抑制流感病毒复制。在复制过程中病毒基因组有较高突变率，为防止病毒逃逸采用的主要策略是靶向病毒基因组多个位点，或者病毒复制不同阶段RNA序列，设计siRNAs进行RNAi组合的方法。其中最常用的RNAi组合方法是在一个质粒载体里包含多个shRNA表达盒，而且这些表达盒分别由相同的或不同启动子调控（Lambethetal.，2010；Songetal.，2008）。Li等（2011）发现多表达siRNA能够有效抑制猪瘟病毒的复制。其构建了单表达、双表达和四表达靶向猪瘟病毒NPro、NS3和NS5B基因siRNA的重组载体，在细胞水平研究抗性基因抑制猪瘟病毒增殖情况，结果表明与单表达siRNA相比，多表达siRNA抑制猪瘟病毒增殖的效率更高，说明多基因串联表达后能够发挥协同作用，能更有效的抑制病毒复制。Mx是一种由I型（α/β）和III型（λ）干扰素（IFN）诱导的具有GTPase活性的抗病毒蛋白，Mx基因只有接到由I型或III型IFN的诱导信号才能表达。通过对多种动物的Mx蛋白抗病毒研究发现，Mx蛋白具有广谱的抗病毒功能，已证明其具有抑制流感病毒、汉坦病毒、Thogoto病毒、乙型肝炎病毒和水泡性口膜炎病毒等病毒复制的作用（OttoHaller，2014），Yi等（2011）发现将人MxA基因转入PK-15细胞和猪成纤维细胞后表达的MxA蛋白能够抑制猪瘟病毒在细胞内复制；Dan等（2014）发现猪Mx1蛋白在细胞水平也具有抑制猪瘟病毒的复制的功能；Xiao将猪Mx1蛋白与HIV-1Tat蛋白融合表达后，在细胞内证实猪Mx1蛋白能够抑制水泡性口炎病毒增殖（Xiaoetal.，2013）；傅德智将鸡Mx基因与流感病毒NA基因联合，转染CEF细胞，发现该联合基因能够提高细胞对新城疫病毒的抵抗力，并利用睾丸注射法将其转入鸡体内，制备转基因鸡，证实其能稳定遗传至F1代（傅德智，2012）。本研究组前期已通过生物信息学分析、细胞水平筛选以及转基因小鼠水平的攻毒保护试验验证，证明了多靶点RNAi、Mx和shRNA基因具有抗流感病毒的作用；在此基础上，构建联合表达抗流感的RNAi、Mx和shRNA三基因的重组载体，通过体细胞核移植技术将其转入猪体内，培育了表达4shRNA-Mx-RNAi三基因的转基因猪，利用分子生物学技术筛选出F0代和F1代阳性转基因猪，研究表达多基因转基因猪的遗传稳定性。为探索新的抑制流感病毒复制策略和转基因抗流感研究提供转基因猪模型。2.1材料与方法2.1.1实验材料代孕雌性大白猪购自哈尔滨三元种猪场。9 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究2.1.2主要实验仪器ZHWY-2102型空气浴震荡器，ThermoFisher蛋白快速转膜系统，HPX-9082MBE数显电热培养箱，DK-8D型电热恒温水槽，SmartGel一体化凝胶成像分析系统，DYY-11B型三恒电泳仪（北京市六一仪器厂），WD-9403紫外分析仪，分子杂交仪、紫外交联仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），BioRedmycyclerPCR仪。2.1.3主要试剂限制性内切酶XbaI、MluI购自NEB公司产品，pMD18-T载体、rTaq聚合酶、DNA标准（DL2000）购自宝生物工程（大连）有限公司产品，TissueDNAkit、HPTotalRNAKit、TotalDNA/RNAProteinKit购自OMEGA公司产品，PCR引物由invitrogen公司合成，Southern地高辛标记探针试剂盒、Southern杂交与检测试剂盒均购自Roche公司，血基因组DNA试剂盒购自AXYGEN公司，反转录试剂盒购自TaKaRa公司。2.1.4试剂配制（1）20×SSC：称取NaCl175.3g，称取柠檬酸钠88.2g溶解到800ml去离子水中，PH值调节到7.0后1000mL定容，高压灭菌后常温保存备用。（2）变性液：称取NaCl87.66g，NaOH20g溶解到800mL去离子水中，定容至1000mL，常温保存备用。（3）中和液：称取NaCl87.66g，Tris-base121g溶解到800mL去离子水中，待全部溶解调节PH值到7.4，定容至1000mL，常温保存备用。（4）组织裂解液（SNET）：称取2.337gNaCl，0.186gEDTA，0.242gTris-Base，1gSDS溶于80ml去离子水中，完全溶解后定容至100mL，0.45um滤膜过滤后，室温保存。（5）50×TAE：称取Tris24.2g，Na2EDTA•2H2O37.2g，加约800mL去离子水，加57.1mL醋酸，定容至1000mL2.1.5引物设计及合成根据一已知的目的基因序列，采用生物信息学软件Oligo7.0设计RNAi、Mx、mU6+h7sk、4shRNA扩增引物，并由Invitrition公司合成，如表2.1。10 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究表2.1引物序列表Table2.1Sequencesofprimers引物名称引物序列(5’-3’)产物(bp)PrimerPrimersequence(5’-3’)Product(bp)RNAi-FTGTGAGAGGCTCAGGAATG272RNAi-RTTGCAAGATTGCTCAGTTCMx-FCAGCTAGCATGAACAATCCATGGTCCAA563Mx-RGCCTCGAGCTACAGAGACTTAAAGTCTACmU6+h7sk-FCAAGGCTTTTCTCCAAGGGAT520mU6+h7sk-RCGTCATCAACCCGCTCCAA4shRNA-FGGCCTATTTCCCATGATTCCT13154shRNA-RCGTCATCAACCCGCTCCAAeT–P-FGAGACAGAAACTTTCGAAGC81eT–P-RGAAGTCTGTGGTATCCAATCC2.1.6转基因猪的制备2.1.6.1重组慢病毒载体的构建与鉴定合成60bp小片段命名为RDNA，片段内包括5`-Cla1-Xma1-Xho1-Mlu1-Xba1-3`。用Cla1和Xba1双酶切载体3572，用RDNA连接，新载体命名为3572A。用Xba1单切pGenesil-2.1得到3`-CMV-shRNAi-5`，Xba1单切3572A并与3`-CMV-shRNAi-5`连接，用Mlu1单切阳性质粒检测3`-CMV-shRNAi-5`在3572载体上的方向，小片段长度为708bp，构建好的载体命名3572B。扩增Mx-RNAi，上游为Nhe1酶切位点，下游为Xma1。Nhe1和Xma1双酶切3572B和Mx-RNAi基因，连接。进行酶切鉴定。2.1.6.2重组慢病毒的包装与浓缩LV-shRNAis-Mx-RNAi的包装和浓缩是按照Invitrogen慢病毒包装系统和脂质体2000转染说明，将pLV-shRNAis-Mx-RNAi慢病毒表达载体与ViralPowerTMPackingMix（通过）共转染至融合度达80%的293FT，转染4-6h后，弃原转染混合物，更换为含有10%FBSDMEM完全培养基；72h后收取细胞上清液。将细胞上清液以4000g，10min进行粗离心去除细胞碎片；然后用0.45μm滤器过滤后以20000g，2h进行超速离心，以1/100体积于无血清DMEM中4℃溶解过夜。2.1.6.3重组慢病毒滴度检测将MDCK细胞接种到24孔板中，待细胞汇合度达70-80%时，将重组慢病毒用10%FBS的-1-5DMEM培养基做10-10稀释，每个梯度接种500µL病毒稀释液（1μLpolybrene）设置两个复孔，感染病毒48h后，洗掉培养基，用无菌的PBS洗3次，胰酶消化细胞提取基因组，PCR检测目的基因的整合。11 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究2.1.6.4猪阳性成纤维细胞的筛选与鉴定将猪成纤维细胞接种至12孔板，待细胞融合度达70%左右；慢病毒感染，以MOI=1的慢病毒接种细胞，病毒感染细胞24h后，换上新鲜培养基，病毒感染48h后，用浓度为1.5μg/mL和2.0μg/mL嘌呤霉素的培养基对感染细胞和阴性未感染细胞进行筛选；待阴性细胞全部死亡，慢病毒感染细胞长势稳定后，分别提取慢病毒感染和未感染细胞的基因组进行目的基因的检测。2.1.6.5体细胞核移植技术生产转基因猪将慢病毒感染1次和2次的大白猪胎儿成纤维细胞为核供体，构建克隆胚胎，将胚胎移植到代孕母猪子宫内发育，生产F0代克隆猪（克隆猪的制备是由课题合作单位东北农业大学完成）。2.1.7F0代转基因猪鉴定2.1.7.1DNA水平分析剪取F0代克隆猪和同品种野生型（WT）猪尾组织，抽取F0代克隆猪和同品种WT猪血液，用OMEGA组织基因组提取试剂盒提取猪尾基因组，用AXYGEN血液基因组提取试剂盒提取血液的基因组。以所提取的基因组为模板，用表2.1中的引物进行PCR，PCR反应采用25μl体系，组分为：rTaq12.5μl上游引物（10uM）0.5μl下游引物（10uM）0.5μl模板1μlddH2O补至25μl反应条件为95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃35s，35个循环；72℃7min；反应结束后取10μlPCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因的扩增效果。将提取的转基因猪尾组织基因组DNA10μg用MluI和XbaI酶切，酶切体系为：基因组DNA10μgMluI（10U/μl）3μlXbaI（10U/μl）3μl10×NEBbuffer5μlddH2O补至50μl酶切条件为37℃水浴10h；配置0.8%琼脂糖凝胶电泳，上样后于冰浴上25V恒压过夜电泳。于凝胶成像系统中观察酶切及电泳结果，处理凝胶；将凝胶置于合适容器内进行变性处理，即用ddH2O将切下的凝胶于室温摇床上洗5min，于变性液中变性20min，重复一次，ddH2O冲洗2-5min，于中和液中中和20min，重复一次，20×SSC中平衡10min；应用毛细管虹吸印迹法将DNA转到尼龙膜上；转膜结束后，将尼龙膜进行紫外交联，然后加42℃预热杂交液DIGEasyHyb，于杂交炉中作用30min，取适量探针煮沸5min置于冰浴后加入杂交液中，倒掉预杂交液后将探针杂交12 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究液混合物加到膜上孵育过夜；杂交结束后，取出尼龙膜，经2×SSC，0.1%SDS洗脱缓冲液在15-25℃条件摇洗5min，重复一次。再于65-68℃条件经0.5×SSC，0.1%SDS洗15min，重复一次；然后，进行显色，即在Washingbuffer中平衡1-5min，然后在blockingsolution中孵育30min，抗体孵育30min，washingbuffer洗2次，每次15min，最后在detectionbuffer中平衡2-5min，避光，将尼龙膜在避光条件下加入colorsubstratesolution进行显色，目的条带出现后加入TEbuffer终止反应，照相记录结果。2.1.7.2RNA水平分析剪取F0代克隆猪和同品种野生型（WT）猪尾组织，抽取F0代克隆猪和同品种WT猪血液，用OMEGARNA提取试剂盒(HPTotalRNAkit)提取猪尾组织RNA，以提取的RNA为模板进行反转录，反应体系为10μl，组分为：5×PrimerscriptBuffer2μlPrimerscriptRTEnzymemixI0.5μlOligodtprimer0.5μlRandom6mers0.5μlTotalRNA500ngRnaseFreeH2O补至10μl反应条件为37℃15min；85℃5s。以反转录产物cDNA为模板，利用表2.1中引物进行RT-PCR。2.1.7.3蛋白质水平分析采用F0代克隆猪尾组织进行Westernblot试验，检测Mx蛋白的表达情况。液氮研磨组织，4℃于含有PMSF的裂解液处理1h，12000g离心20min吸取上清分装，得到蛋白，制备聚丙烯酰胺凝胶（12%分离胶、5%浓缩胶），取蛋白样品加5×SDSPAGE蛋白上样上样缓冲液，沸水煮5min，使蛋白变性。用上样针将蛋白加入胶孔，80v恒压电泳30min，120V恒压1h；电泳结束后，轻取出凝胶，除去浓缩胶，剪略大于凝胶的PVDF膜4张略小于凝胶的滤纸，将PVDF膜在甲醇中浸泡30s后，浸于转膜缓冲液中，将凝胶、滤纸浸于转膜缓冲液中，按照滤纸、PVDF膜，凝胶、滤纸顺序放入转膜仪中，10V恒压转移1h；转膜结束后，取出膜标记正反面，移至5%脱脂奶粉封闭液中，摇动封闭2h。将膜放于1：1000稀释的TBST一抗稀释液中，室温摇动孵育1h，TBST缓冲液摇动洗脱3次，每次10min。将膜置于1：5000稀释的TBST红外荧光标记二抗稀释液中室温孵育1h，用TBST洗脱缓冲液摇洗3次，每次10min；照相记录结果。2.1.7.4转基因拷贝数检测将含外源基因的质粒p3572-4shRNAi-Mx-RNAi与野生型猪基因组DNA混合，设置含有1、2、4、8和16个转基因拷贝数的标准品，即如果含有转基因片段的质粒大小为abp，野生型猪9基因组DNA用量为bng，由于猪基因组DNA单倍体大小为3×10bp，那么bng的转基因阳13 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究9性猪基因组DNA含有一个转基因拷贝的质量为：a×b×0.5/3×10ng；以引物Mx扩增Mx基因片段,以eT-P扩增管家基因作为内参，标化基因组DNA的量。采用20μlPCR的反应体系：上游引物（10uM）0.5μl；下游引物（10uM）0.5μl；ddH2O8μl；模板1μl；反应条件为95℃10s，95℃5s(40个循环)，60℃31s；95℃15s，60℃30s，95℃15s；在96孔板中混匀并用超净光盖盖住。使用专业软件收集、分析反应结果，其中每个样品3个重复。2.1.7.5整合位点分析以构建的重组慢病毒载体序列为模板，设计特异性引物，其中上游引物碱基序列为：SPS1：5'-GAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGC-3'；SPS2：5'-TACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTAC-3'；SPS3：5'-GCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGC-3'。下游引物碱基序列为：SPA1：5'-AGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC-3'；SPA2：5'-AGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAG-3'；SPA3：5'-ATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTG-3'。分别与七个简并引物组成引物组合，对整合位点的上游和下游侧翼序列进行Tail-PCR扩增。（1）Tail-PCR扩增的第一轮反应体系：基因组DNA100ng10×buffer2μldNTP1.6μl特异性引物（F1/R1）2.5μl简并引物（AD1-AD6）6μlLA-Taq酶0.2μlddH2Oupto20μl反应程序：94℃1min，98℃1min，（94℃30s，65℃1min，72℃3min）5个循环；94℃30s，25℃3min，72℃3min，（94℃30s，65℃1min，72℃3min，94℃30s，65℃1min，72℃3min，94℃30s，44℃1min，72℃3min）15个循环；72℃10min，4℃+∞。（2）Tail-PCR扩增的第二轮反应体系：第一轮PCR产物（1:200稀释）1μl10×buffer2μldNTP1.6μl特异性引物（F2/R2）2.5μl简并引物（AD1-AD6）6μlLA-Taq酶0.2μlddH2Oupto20μl反应程序：（94℃30s，65℃1min，72℃3min，94℃30s，65℃1min，72℃3min，94℃30s，44℃1min，72℃3min）15个循环；72℃10min，4℃+∞。14 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究（3）Tail-PCR扩增的第三轮反应体系：第二轮PCR产物（1:200稀释）1μl10×buffer2μldNTP1.6μl特异性引物（F3/R3）0.5μl简并引物（AD1-AD6）2μlLA-Taq酶0.2μlddH2Oupto20μl反应程序：同第二轮扩增取15μl第三次PCR扩增的产物，1%的琼脂糖凝胶电泳检测得到的结果，胶回收750-2000bp左右的特异性目的片段；胶回收后连接T载体，转化，克隆，测序；将测序得到的序列在NCBI网站上通过BLAST程序与GenBank中鸡的已知核酸序列进行比对分析；根据测序结果正确的序列，设计特异性引物，用以验证转基因鸡的整合位点。2.1.8F1代转基因猪鉴定2.1.8.1DNA水平分析剪取F1代转基因猪和同品种野生型（WT）猪尾组织，抽取F1代转基因猪和同品种WT猪血液，用OMEGA组织基因组提取试剂盒(TissueDNAkit)提取猪尾基因组，用AXYGEN血液基因组提取试剂盒提取血液基因组。以提取的猪基因组作为模板，用表2.1中的引物进行PCR，PCR反应采用25μl体系，组分为：rTaq12.5μl上游引物（10uM）0.5μl下游引物（10uM）0.5μl模板1μlddH2O补至25μl反应条件为95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃35s，35个循环；72℃7min；反应结束后取10μlPCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因的扩增效果。将提取的转基因猪尾组织基因组DNA10μg用MluI和XbaI酶切，酶切体系为基因组DNA10μg，MluI（10U/μl）3μl，XbaI（10U/μl）3μl，10×NEBbuffer5μl，ddH2O补至50μl；酶切条件为37℃水浴，10h；配置0.8%琼脂糖凝胶电泳，上样后于冰浴中25V恒压过夜电泳。于凝胶成像系统中观察酶切及电泳结果，处理凝胶；将凝胶置于合适容器内进行变性处理，即用ddH2O将切下的凝胶于室温摇床上洗5min，于变性液中变性20min，重复一次，ddH2O冲洗2-5min，于中和液中中和20min，重复一次，20×SSC中平衡10min；应用毛细管虹吸印迹法将DNA转到尼龙膜上；转膜结束后，将尼龙膜进行紫外交联，然后加入42℃预热杂交液DIGEasyHyb，于杂交炉中作用30min，取适量探针煮沸5min置于冰浴后加入杂交液中，倒掉预杂交液后将探针杂交液混合物加到膜上孵育过夜；杂交结束后，取出尼龙膜，经2×SSC，0.1%SDS洗脱缓冲液在15-25℃15 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究条件摇洗5min，重复一次。再于65-68℃条件经0.5×SSC，0.1%SDS洗15min，重复一次；然后，进行显色，即在Washingbuffer中平衡1-5min，blockingsolution孵育30min，antibodysolution孵育30min，washingbuffer洗2次，每次15min，detectionbuffer平衡2-5min，避光，将尼龙膜在避光条件下加入colorsubstratesolution进行显色，目的条带出现后加入TEbuffer终止反应，照相记录结果。2.1.8.2RNA水平分析剪取F1代转基因猪和同品种野生型（WT）猪尾组织，抽取F1代转基因猪和同品种WT猪血液，用OMEGARNA提取试剂盒(HPTotalRNAkit)提取猪尾组织RNA，以提取的RNA为模板进行反转录，反应体系为10μl，组分为：5×PrimerscriptBuffer2μlPrimerscriptRTEnzymemixI0.5μlOligodtprimer0.5μlRandom6mers0.5μlTotalRNA500ngRnaseFreeH2O补至10μl反应条件为37℃15min；85℃5s。以反转录产物cDNA为模板，利用表2.1中引物进行RT-PCR。2.1.8.3蛋白质水平分析采用F1代转基因猪尾组织进行Westernblot试验，检测Mx蛋白的表达情况。液氮研磨组织，4℃于含有PMSF的裂解液处理1h，12000g离心20min吸取上清分装，得到蛋白，制备聚丙烯酰胺凝胶（12%分离胶、5%浓缩胶），取蛋白样品加5×SDSPAGE蛋白上样上样缓冲液，沸水煮5min，使蛋白变性。用上样针将蛋白加入胶孔，80v恒压电泳30min，120V恒压1h；电泳结束后，轻取出凝胶，除去浓缩胶，剪略大于凝胶的PVDF膜和4张略小于凝胶的滤纸，将PVD膜在甲醇中浸泡30s后，浸于转膜缓冲液中，将凝胶、滤纸浸于转膜缓冲液中，按照滤纸、PVDF膜，凝胶、滤纸顺序放入转膜仪中，10V恒压转移1h；转膜结束后，取出膜标记正反面，移至5%脱脂奶粉封闭液中，摇动封闭2h。将膜放于1：1000稀释的TBST一抗稀释液中，室温摇动孵育1h，TBST缓冲液摇动洗脱3次，每次10min。将膜置于1：5000稀释的TBST红外荧光标记二抗稀释液中室温孵育1h，用TBST洗脱缓冲液摇洗3次，每次10min；照相记录结果。2.2结果2.2.1转基因猪的制备2.2.1.1重组慢病毒载体的构建与鉴定16 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究将合成的RNAi、Mx和4shRNA表达盒插入3572慢病毒载体中，构建重组慢病毒载体，经过酶切鉴定，结果显示重组慢病病毒载体构建成功，如图2.1和2.2。图2.1重组慢病毒pLV-shRNAs-Mx-RNAi图谱Fig2.1ThemapofpLV-shRNAs-Mx-RNAi图2.2重组慢病毒载体酶切鉴定图Fig2.2EnzymedigestionofpLV-shRNAs-Mx-RNAi注：M：DL15000；pLV：重组慢病毒载体2.2.1.2慢病毒的包装、浓缩与滴度检测按照Invitrogen慢病毒包装系统和脂质体2000转染说明对LV-shRNA-Mx-RNAi的包装和浓缩，根据公式n×计量孔稀释倍数/接种病毒体积，计算慢病毒滴度为3-361000µL/500µL×10/0.5×10=4×10TU/mL，如图2.3所示：17 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究图2.3重组慢病毒滴度检测结果Fig2.3Thedroptestresultsofrecombinantlentivirus注：M:DL2000Marker，-1—-5：为重组慢病毒稀释度2.1.1.3猪阳性成纤维细胞的筛选与鉴定慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞后，通过含有嘌呤霉素的培养基对感染细胞和阴性未感染细胞进行筛选；待阴性细胞全部死亡，慢病毒感染细胞长势稳定后，分别提取慢病毒感染和未感染细胞的基因组进行目的基因的检测，检测结果如图2.4所示。图2.4慢病毒感染猪胚胎成纤维细胞的PCR结果Fig2.4ThePCRResultsofpigembryonicfibroblastsinfectedbylentivirus注：M：DL2000；+：pLV-4shRNA-Mx-RNAi质粒；LV：慢病毒感染的成纤维细胞；WT：未处理的成纤维细胞2.1.1.4F0代和F1代转基因猪获得了3头健全的F0代转基因猪，与同品种WT猪相比生长状态无异常。待F0代猪发育至性成熟期时，利用人工授精方法，与同品种野生型猪杂交，繁育F1代，授精后120d获得4头转基因猪，与同品种WT猪相比生长状态无异常。2.2.2F0代转基因猪的转基因整合分析2.2.2.1F0代转基因猪的PCR分析取F0代克隆猪尾组织和血液基因组，以其为模板，分别以mU6+h7sk和RNAi为引物进行PCR扩增转基因片段，以线性化载体设立阳性对照，以WT猪尾组织和血液基因组作为阴性对照，水作为空白对照。结果显示，3头猪均扩增出了与预期大小的目的条带，阳性对照和阴性对照成18 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究立，表明所获得的3头转基因猪基因组中均有外源基因的整合，如图2.5和图2.6。AB图2.5F0代猪尾组织基因组RCR结果Fig2.5ResultsofF0transgenicswinetissuegenomebyPCRM：DL15000；1：1305；2：1314；3：1315；4：WT；5：ddH2O；6：阳性质粒A：mU6+h7sk为引物B：RNAi为引物AB图2.6F0代猪血液基因组PCR结果Fig2.6ResultsofF0transgenicswinebloodgenomebyPCRM：DL15000；1：1305；2：1314；3：1315；4：WT；5：ddH2O；6：阳性质粒2.2.2.2F0代转基因猪的Southernblot分析F0代克隆猪尾组织基因组DNA经XbaI和MluI双酶切后，进行Southernblot分析，以线性化载体设立阳性对照，以WT猪尾组织基因组DNA作为阴性对照。Southernblot检测结果显示，3头猪均杂交出1315bp目的条带，表明目的基因已经整合到这3头转基因猪基因组，如图2.7。图2.7F0代猪尾组织基因组Southernblot结果Fig2.3ResultsofF0transgenicswinebySouthernblotM：DL15000；1：1305；2：1314；3：1315；4：WT；5：阳性质粒2.2.3F0代转基因猪的转基因表达分析19 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究2.2.3.1F0代转基因猪RNA水平分析为了进一步分析目的基因的转录情况，以提取的F0代猪尾组织和血液RNA作为模板，进行RT-PCR，以线性化载体设立阳性对照，以WT猪尾组织和血液基因组和水作为阴性对照。结合阳性对照和内参证明3头猪在RNA水平都有外源基因的表达，如图2.8和2.9。AB图2.8F0代猪尾组织基因组RT-PCR结果Fig2.8ResultsofF0transgenicswinetissuegenomebyRT-PCRM：DL15000；1：1305；2：1314；3：1315；4：WT；5：ddH2O；6：阳性质粒A：mU6+h7sk为引物B：RNAi为引物AB图2.9F0代猪血液基因组RT-PCR结果Fig2.9ResultsofF0transgenicswinebloodgenomebyRT-PCRM：DL15000；1：1305；2：1314；3：1315；4：WT；5：ddH2O；6：阳性质粒A：mU6+h7sk为引物B：RNAi为引物2.2.3.2F0代转基因猪蛋白质水平分析以F0代克隆猪尾组织蛋白为对象，分析Mx蛋白表达水平。针对Mx及内参的蛋白免疫印迹试验的试验结果显示，3头F0代猪尾组织中，均有Mx蛋白的表达，表达情况如图2.10。20 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究图2.10F0代猪尾组织Mx蛋白免疫印迹杂交结果Fig2.10ResultsofF0transgenicswinebyWesternblottingM：Marker；1：1305；2：1314；3：1315；4：WT；5：阳性对照2.2.4F0代转基因猪的转基因拷贝数检测将转基因质粒p3572-4shRNA-Mx-RNAi与野生型猪基因组DNA混和，设置了含有1、2、4、8、16个拷贝的标准品，以Mx扩增引物扩增猪基因组中Mx基因，以eT-P扩增管家基因作为内参，每个反应3次重复，计算每个重复值后取平均C(t)值。将外源基因片段检测引物扩增C(t)Mx减去相应的TFRC基因的扩增C(t)内参，得到ΔC(t)，以ΔC(t)对样品拷贝数的对数(log2N)作图，获得改进型的绝对定量标准曲线。以ΔC(t)Mx与拷贝数的对数(log2N)做标准曲线，决定系数也较22高(R=0.996)，计算公式为：log2N(拷贝数)=-1.385ΔCt+8.223(R=0.996)，经计算转基因拷贝数分别为2.30、2.03、2.15，结果如图2.11和表2.2。ABCD图2.11转基因拷贝数检测Fig2.11DecteionoftransgenecopynumberA：标准品扩增曲线；B：标准品标准曲线；C：内参扩增曲线；D：转基因拷贝数标准曲线21 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究表2.2F0代转基因猪转基因拷贝数Table2.2ThetransgenecopynumberofF0pigsPigCt值△Ct值N（拷贝数）130522.756.552.30131423.587.382.03131523.527.322.152.2.5整合位点分析与验证2.2.5.1整合位点分析提取1314号转基因猪尾组织基因组DNA作为模板，利用设计的特异性引物分别与七个简并引物组成引物组合，对整合位点的上游和下游侧翼序列进行Tail-PCR扩增，取15µl第三次PCR扩增的产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2.12。图2.12Tail-PCR第三轮PCR扩增的核酸电泳结果Fig.2-12Tail-PCRinthethirdroundPCRamplificationofnucleicacidelectrophoresisresμltsM：DL5000；1-7为特异性引物与简并引物组合：S3-AD1；S3-AD2；S3-AD3；S3-AD4；S3-AD5；S3-AD6；S3-AD7；胶回收第三轮Tail-PCR扩增在750-2000bp左右的特异性目的片段，连T载，转化，克隆，测序；将测序得到的序列在NCBI网站上通过BLAST程序与GenBank中猪的已知核酸序列和所构建的载体序列进行比对分析，结果表明目标序列整合到猪的9号染色体上，结果如图2.13。22 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究图2.13Tail-PCR产物序列比对分析Fig.2.13SequencealignmentanalysisofTail-PCRproduction2.2.5.2整合位点结果验证根据测序结果序列设计特异性验证引物，以1314号转基因猪基因组为模板扩增的条带大小为650bp，与预期结果一致，如图2.14。图2.14整合位点验证引物PCR扩增结果Fig.2.14PCRamplificationofintegrationsitesvalidationprimersM：DL5000；1-3：WT基因组；4-6：1314基因组胶回收目的条带，连T载，转化，克隆，测序；将测序得到的序列在NCBI网站上通过BLAST程序与GenBank中猪的已知核酸序列和所构建的载体序列进行比对分析，结果表明目标序列整合到猪的9号染色体上，所得结果与前面一致，表明验证正确，如图2.15。23 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究图2.15整合位点验证引物PCR扩增产物序列比对分析Fig.2.15SequencealignmentanalysisofPCRamplificationofintegrationsitesvalidationprimers2.2.6F1代转基因猪的转基因整合分析2.2.6.1F1代转基因猪的PCR分析取F1代转基因猪尾组织基因组，以其为模板，分别以mU6+h7skh和RNAi为引物进行PCR扩增转基因片段，以线性化载体设立阳性对照，以水为空白对照，WT猪尾组织基因组作为阴性对照。PCR扩增结果显示，4头转基因猪有1头扩增出了与预期大小的目的条带，说明所获得的4头转基因猪基因组中只有1头有外源基因的整合，如图2.16。AB图2.16F1代猪尾组织基因组PCR结果Fig2.16ResultsofF1transgenicswinetissuegenomebyPCRM：DL2000；1：153-01；2：153-04；3：153-06；4：153-08；5：WT；6：ddH2O；7：阳性质粒A：mU6+h7sk为引物B：RNAi为引物2.2.6.2F1代转基因猪Southernblot分析F1代转基因猪尾组织基因组DNA经XbaI和MluI双酶切后，进行Southernblot鉴定，以线性化载体设立阳性对照，以WT猪尾组织基因组DNA作为阴性对照。Southernblot检测结果显示，有1头猪杂交出1315bp目的条带，表明目的基因已经整合到这头转基因猪基因组，如图24 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究2.17。图2.17F1代猪尾组织基因组Southernblot结果Fig2.13ResultsofF1transgenicswinebySouthernblotM：DL15000；1：153-01；2：153-04；3：153-06；4：153-08；5：WT；6：阳性质粒2.2.7F1代转基因猪的转基因表达分析2.2.7.1F1代转基因猪RNA水平分析为了进一步分析目的基因的转录情况，以提取F1代猪尾组织RNA作为模板，进行RT-PCR，以线性化载体设立阳性对照，以WT猪尾组织基因组为阴性对照，水作为空白对照。结合阳性对照和内参证明有1头猪在RNA水平有外源基因表达，如图2.18。AB图2.18F1代猪尾组织基因组RT-PCR结果Fig2.18ResultsofF1transgenicswinetissuegenomebyRT-PCRM：DL2000；1：153-01；2：153-04；3：153-06；4：153-08；5：WT；6：water；7：阳性质粒A：mU6+h7sk为引物B：RNAi为引物2.2.7.2F1代转基因猪蛋白质水平分析以F1代转基因猪尾组织蛋白为对象，分析Mx蛋白表达水平。针对Mx及内参的蛋白免疫印迹试验的试验结果显示，1头猪有Mx蛋白的表达，表达情况如图2.15。25 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究图2.19F1代猪尾组织Mx蛋白免疫印迹杂交结果Fig2.19ResultsofF1transgenicswinebyWesternblotM：Marker；1：WT；2：153-01；3：153-04；4：153-06；5：153-08；2.3讨论RNA干扰是在进化过程中产生的防御病毒入侵的免疫机制，在细胞内抑制病毒复制时，不会损伤感染的细胞，通过设计靶向病毒某个基因或多个基因的siRNA，导入细胞内后可阻断病毒的复制过程，这一技术在抗病毒研究中得到广泛应用（Lietal.，2014）。靶向病毒基因组保守区域设计siRNA，或者靶向病毒感染细胞过程中所必需的辅助因子设计siRNA，然后将其导入细胞内，就可在细胞内抑制病毒的复制，阻断病毒增殖。但siRNA导入细胞后仍有一些无法克服的缺点，首先siRNA在细胞内易被降解（Dasetal.，2004），使得RNAi的抑制效应持续时间很短，为了避免这一缺点，研究者们发现了短发夹RNA；其次病毒基因组在复制过程中易发生突变，而导致其对siRNA的敏感性，特别是RNA病毒（Gitlinetal.，2005）。目前为防止病毒逃逸采用的主要策略是靶向病毒基因组多个位点，或着病毒复制不同阶段RNA序列，设计siRNAs进行RNAi组合的方法。其中最常用的RNAi组合方法是在一个质粒载体里包含多个shRNA表达盒，而且这些表达盒分别由相同的或不同启动子调控（Lambethetal.，2010；Songetal.，2008）。Li等（2011）发现多表达siRNA不但可以提高抑制病毒增值效率，而Pro且能够防止病毒逃逸RNA干扰作用，其构建了单表达、双表达和四表达靶向猪瘟病毒N、NS3和NS5B基因siRNA的重组载体，在细胞水平研究抗性基因抑制猪瘟病毒增殖情况，结果表明多表达猪瘟病毒抗性基因抑制猪瘟病毒增殖的效果优于单表达猪瘟病毒抗性基因。本研究中转基因猪外源基因RNAi是利用RNAi技术靶向流感病毒NP、PA和PB2这三个基因设计siRNA的靶点，因为这些基因非常保守并且它们在病毒复制周期中有重要作用。流感病毒RNA的转录和复制过程，依赖NP和3种RNA依赖的RNA聚合酶，即由PB1、PB2和PA组成的核糖核蛋白酶复合体（RNP），NP与其他聚合酶蛋白一起调节病毒RNA的转录与合成间转换，同时NP还可以防止RNA合成过程的中断以利于RNA链的延伸；PA是RNA依赖的RNA聚合酶组成成分之一，是流感病毒RNA复制的基础，若PA的含量降低，RNA片段的转录及复制会被阻断，从而使流感病毒增殖受到抑制；PB2基因在病毒mRNA合成的启动和延伸方面有重要作用（Massinetal.，2001），所以NP、PA或PB2基因是RNAi阻断流感病毒进行复制的理想靶基因片段。理论上同一个载体上继续增加siRNA表达盒可以继续提高抑制病毒复制的效率，但同一个载体表达三个或更多个siRNA表达盒就会增加大量的重复序列，在细胞内能够自发重组而删掉中间序列，这样就26 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达多基因转基因猪的制备与遗传稳定性研究会使抑制效率降低（Lietal.，2011）。为了避免重组，我们构建了四个不同启动子分别启动四个不同干扰靶点的载体，分别用RNA聚合酶III型启动子h7SK、hH1、hU6及mU6表达靶向流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的shRNA的表达，将4个shRNA表达盒串联后与RNAi和Mx基因联合，克隆到慢病毒载体，转染细胞经过筛选后，获得核供体细胞，进而制备获得转基因猪，为研究多基因发挥协同抑制流感病毒复制作用。1992年，Muller等（1992）通过显微注射技术制备过转鼠Mx1基因的转基因猪，鉴于Mx1蛋白独特核定位特性与广谱的抗病毒能力，他们拟构建能够抵抗流感病毒的转基因猪新品种。基于某些特定动物体内Mx具有蛋白具有抗病毒活性，可以建立表达Mx蛋白的动物模型研究相关免疫机制，深入探讨其Mx抗病毒过程存在的细胞信号传导通路，以及调控途径中某些效应因子与动物个体先天性免疫系统的关系（OttoHaller，2014）。Grimm等通过建立Mx阳性小鼠作为模型动物，发现了流感病毒的致病因子（Grimmetal.，2007）。本研究选择鸡Mx基因作为目的基因，Ko等（2002）已证实鸡Mx基因的单核苷酸多态性，其631位氨基酸为Asn时，能够抵抗禽流感病毒和水疱性口炎病毒；而631位氨基酸为Ser时，Mx基因无抗病毒活病性。本实验室克隆了鸡Mx基因，且其631位氨基酸经序列分析为天冬氨酸，构建重组真核表达载体，转染MDCK细胞，感染禽流感病毒后在细胞水平上证实了鸡Mx基因具有抑制禽流感病毒复制的作用（李文超，2008）；2011年，肖志广在细胞水平证明了鸡Mx蛋白能够抑制H5N1流感病毒的复制，且未发现鸡Mx蛋白第631位氨基酸多态性差异（肖志广，2011）。我们利用转基因技术将鸡Mx基因导入猪体内，以期其能产生免疫抵抗力，提高抗流感病毒能力。理论上，因为猪体内含有猪Mx基因，所以会有Mx蛋白的表达。目前已有诸多研究表明在没有IFN存在时或者没有受到病毒刺激时，猪体内不会有Mx蛋白的表达（Durandetal.，2009；Danetal.，2014）。而且，我们利用CMV启动子来启动表达Mx基因，启动效率远高于猪自身启动子，所以我们没有检测到猪Mx的表达。利用Mx基因作为流感抗性基因不仅可以减少流感病毒的传播，降低其对养殖业带来的危害，还能提高经济效益带动畜牧业的发展。外源基因的遗传指外源基因在转基因动物世代传递过程中能传递给子代，且子代能够表现出明显的表型特征，如果外源基因能够稳定遗传给后代并且在后代中能稳定的表达，那么就认为外源基因能够遗传（YamauchiY，2007）。而制备转基因动物最重要的就是外源基因能够稳定整合到宿主基因组，且能稳定遗传给后代。进行转基因猪外源基因的鉴定，首先是转基因整合鉴定，采用的主要方法有PCR技术和分子原位杂交技术，即通过PCR或Southemblot进行转基因的整合情况检测，通过荧光定量PCR和热不对称交错PCR进行转基因整合位点分析；其次是进行转基因表达分析，即通过RT-PCR、Northernblot进行转录水平分析，通过Westernblot等方法进行蛋白表达水平分析；最后是转基因的功能分析，如研究转基因的抑制病毒复制情况（李江南，2011）。本研究分别采用PCR、Southernblot方法在DNA水平进行了转基因整合鉴定；采用RT-PCR方法在RNA水平进行了转基因的转录分析，采用Westernblot方法进行了蛋白表达水平分析。结果表明3头F0代转基因猪基因组中均有目的基因的整合与表达，为阳性转基因猪；5头F1代转基因猪中其中1头猪基因组中有目的基因的整合与表达，鉴定为为阳性转基因猪，表明外源基因能够稳定遗传至F1代。27 中国农业科学院硕士学位论文第三章体外研究转基因猪抑制流感病毒活性第三章体外研究转基因猪抑制流感病毒活性猪流感（SwineInfluenza，SI）是由正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒（InfluenzaAvirus，IAV）引起的一种急性高度接触性传染疾病，能在猪上呼吸道上皮细胞复制，引起猪呼吸器官感染（NelsonMetal.，2012），进而致使免疫系统稳态变化，导致细菌、支原体或其他病毒的继发或混合感染，使疫情加重，病猪死亡率上升，给养猪业带来极大的经济损失（VijaykrishnaDetal.，2011）。低致病性流感病毒经基因突变或基因重组会转变成高致病性的流感病毒，而高致病性的流感病毒在人群中成为引发流感的一个潜在危险因素，严重威胁人类健康。RNA干扰技术被认为是最有效的抗病毒的方法之一，在病毒学研究得到广泛应用。随着RNAi技术和转基因技术的发展，可将有利于改善动物性状和有抑制病毒复制能力的外源基因转入动物的基因组使其在动物体内表达，从而产生具有新遗传性状的动物。Han等靶向H5N1流感病毒NS1基因设计合成4个siRNAs，转染到HEK293细胞，在细胞水平进行了试验，结果表明序列特异性的siRNAs能够抑制流感病毒NS1mRNA在细胞内表达，从而抑制了AIV的复制（Hanetal.，2013）。JonLyall等（2011）靶向禽流感病毒保守区域设计鸡U6启动子启动的短发夹RNA表达盒，构建重组慢病毒载体后，转入集体内，制备获得转基因鸡，在鸡体水平证实利用RNAi技术进行鸡的基因改造可以防止鸡感染流感病毒，并能够抑制流感病毒的进一步传播。当宿主受到病毒的侵染时，动物自身的免疫系统会迅速做出应答以抵抗病原在体内的增殖，其中I型和III型IFN诱导的Mx蛋白是一种有效的广谱抗病毒因子，对多种RNA病毒和一些DNA病毒均有抑制作用，包括流感病毒。2010年，Palm等将猪Mx1基因转入细胞内，在细胞水平证实了猪Mx1能够阻断细胞内吞流感病毒的作用，从而抑制流感病毒在细胞内复制（Palmetal.，2010）。Quan等(2014)将猪Mx1基因转入猪体内制备了能够过表达Mx1基因的转基因猪，分离培养其耳尖成纤维细胞，在原代细胞水平评价了其抑制流感病毒活性，证实了猪Mx1基因能够提供转基因猪细胞抵抗病毒的能力。我们已经利用分子生物学及生物化学技术，筛选出F0代阳性表达多基因转基因猪，与WT猪杂交后繁殖获得F1代转基因猪，并筛选获得1头阳性表达多基因转基因猪。为进一步研究其成纤维细胞抑制流感病毒复制能力，本研究分离培养F1代转基因猪成纤维细胞，感染流感病毒后通过IFA、Real-timePCR、病毒滴度测定分析了F1代转基因猪在细胞水平上抑制流感病毒复制的活性，通过原代细胞抑制流感病毒增殖和复制评价转基因猪的抗病毒水平。3.1材料与方法3.1.1实验动物与细胞野生型大白猪购自哈尔滨三元种猪场，MDCK细胞系本实验室保存。3.1.2病毒与载体28 中国农业科学院硕士学位论文第三章体外研究转基因猪抑制流感病毒活性猪流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)(简称GD/2004)毒株，由兽医生物技术国家重点实验室保存；p3572-4shRNAi-Mx-RNAi重组载体由本实验室构建保存。3.1.3主要实验仪器CO2细胞培养箱购自Thermofisher公司，Aviovert200荧光显微镜购自CarlZeizz公司，细胞培养板、细胞培养瓶均购自Corning公司，超纯水器购自，A2生物安全柜购自LABCINCO公司，B2生物安全柜购自Thermofisher公司，LightCycler480实时荧光定量PCR系统购自Roche公司。3.1.4主要试剂Real-timePCR试剂盒购自Roche公司，DMEM购自Gibco公司，FBS购自Hyclone，FITC标记的羊抗小鼠IgG二抗购自中杉金桥公司，鼠抗H1N1病毒阳性血清由本实验室保存，胶原酶（II）等细胞培养试剂购自GIBCO，VirusRNAKit购自OMEGA公司。3.1.5引物设计及合成采用生物信息学软件Oligo7.0设计猪内参基因β-actin扩增引物，H1N1PB2特异性引物，由Invitrition公司合成。表3.1引物序列表Table3.1Sequencesofprimers引物引物序列(5’-3’)产物(bp)PrimerPrimersequence(5’-3’)Product(bp)β-actin-FCAGAGCAAGAGGGGCATC392βactin-RAGGTAGTCGGTCAGGTCCH1-PB2-FAATTACAACAAAGGCACCA247H1-PB2-GCTTCCGTTTCATTACCA5'5'′3.1.6流感病毒毒力测定取一支GD/2004株流感病毒室温解冻，用感染培养基（青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL，-1-8TPCK-Trypsin4μg/mL）将病毒做10-10梯度稀释，每个梯度吸取取100μl接种至已经长成单层MDCK细胞的96孔板中，每个梯度接种5个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱，1.5h后吸弃病毒稀释液，每孔加入100μl含1%FBS的DMEM培养基，48h后观察每孔的细胞病变，当细胞病变出现后吸取上清测定HA效价，统计感染细胞孔数，用Reed-Muench法计算病毒TCID50。3.1.7F1代转基因猪尾成纤维细胞分离培养29 中国农业科学院硕士学位论文第三章体外研究转基因猪抑制流感病毒活性仔猪出生当日，剪取约1-2cm的猪尾，用含5倍双抗（青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL）的PBS洗干净，碘酊消毒，用75%酒精冲洗后转到含有10%FBS的DMEM中；回到实验室后在3在生物安全柜内用含5倍双抗的PBS洗3次，剪取一段置于青霉素瓶内，用手术剪刀剪碎至1mm小块，加入适量胰酶，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中消化，反复消化2次，每次40分钟；然后将其转至15mL离心管中，1500rpm离心5min；去掉消化液后，加入含20%FBS的DMEM培养基重悬细胞和组织，均匀分至6孔细胞培养板中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养；3天后观察细胞铁壁和生长情况，每隔3-4d换培养液；1周后视细胞生长情况进行传代，同时分离培养同日龄同品种WT猪尾组织成纤维细胞，作为对照。3.1.8流感病毒感染猪成纤维细胞F1代转基因猪和WT猪成纤维细胞长成单层后，消化计数后铺至96孔细胞板和48孔细胞48板，分别每孔铺10和10个细胞，24h内接种流感病毒100TCID50/孔，置37℃、5%CO2细胞培养箱中感作1.5h后，然后换1%FBS的DMEM培养基培养。3.1.9间接免疫荧光检测转基因猪成纤维细胞抑制流感病毒增殖16h后取出96孔细胞板中流感病毒感染F1代转基因猪和WT猪成纤维细胞及未感染病毒对照细胞，戏弃培养基后，用PBS在室温摇床上摇洗3次，每次10min；然后每孔中加入50μl于-20℃预冷的甲醇，置于-20℃固定30min；吸弃冷甲醇，于室温放置5min；用PBS洗5min后，加入4℃预冷的5%PBS稀释的BSA进行封闭，每孔加入50μl，室温震摇30min；一抗为100倍稀释的H1N1病毒血清抗体，每孔加入50μl，于37℃温箱中感作1h；PBS洗3次，每次10min；二抗为100倍稀释的FITC标记的羊抗鼠lgG抗体，每孔加入50μl后置37℃温箱中作用1h；PBS洗3次，每次10min；染色完成后用倒置荧光显微镜观察荧光比例并照相。3.1.10实时荧光定量PCR检测流感病毒PB2基因mRNA含量分别在接种流感病毒完成后8h、16h、24h和48h，取出48孔细胞板中流感病毒感染F1代转基因猪和WT猪成纤维细胞及未感染病毒对照细胞，弃去培养液，每孔加入100μl含β-巯基乙醇的GTCbuffer，室温静置1min，将裂解物收集到1.5mL无RNA酶离心管中，按照VirusRNAKit说明书提取病毒RNA。按照反转录试剂盒说明书进行反转录。以反转录产物为模板，用表3.1中的引物进行荧光定量PCR。其中荧光定量PCR反应体系为20μl体系：2×SYBRGreenI10μl上游引物（10uM）0.5μl下游引物（10uM）0.5μlddH2O8μl模板1μl荧光定量PCR反应条件为：H1N1-PB2，95℃5min；95℃10s、56℃20s、72℃20s，4530 中国农业科学院硕士学位论文第三章体外研究转基因猪抑制流感病毒活性个循环；β-actin：95℃5min；95℃10s、53℃20s，72℃15s，45个循环。反应结束后用®LightCycler480实时荧光定量PCR系统分析结果，根据β-actin拷贝数值采用最大二阶导数法-ΔΔCt(2)进行统计学分析。3.1.11细胞上清中流感病毒滴度测定分别在接种流感病毒完成后8h、16h、24h和48h，取出48孔细胞板中流感病毒感染F1代转基因猪和WT猪成纤维细胞及未感染病毒对照细胞，收集细胞上清，冻存于-80℃。冻融上清作-1-810-10梯度稀释，然后接种MDCK细胞，每孔加入100μl，一组5个重复，做3组，于37℃、5%CO2细胞培养箱感作1.5h后，吸弃病毒稀释液，每孔加入100μl含1%FBS的DMEM培养基，48h后观察每孔的细胞病变，当细胞病变出现后吸取上清测定HA效价，统计感染细胞孔数，用Reed-Muench法计算病毒的细胞滴度，以TCID50计。3.1.12数据统计实验数据用平均数与标准偏差表示，采用Spass14.0统计分析软件对数据进行t检验，P<0.05，表示两组数据差异显著，P<0.01表示两组数据差异极显著。3.2结果3.2.1流感病毒TCID50测定结果GD/2004株流感病毒接种MDCK细胞48h后，细胞病变明显，测定细胞上清的病毒HA效-3.8价，统计细胞感染孔数后用Reed-Muench方法计GD/2004株流感病毒的TCID50为10TCID50/mL。3.2.2猪尾成纤维细胞的分离培养以胰酶和胶原酶消化法分离培养了转基因猪和WT猪尾组织成纤维细胞，第3d开始组织块贴壁，然后细胞逐渐从组织块边缘往外生长，大量细胞从第5d开始脱落出来并贴壁生长，在第10d左右汇聚成单层，结果如图3.1。图3.1F1转基因猪尾组织成纤维细胞分离培养Fig3.1IsolationofcellsofF1transgenicswinefrompiglettails31 中国农业科学院硕士学位论文第三章体外研究转基因猪抑制流感病毒活性3.2.3间接免疫荧光检测结果猪尾成纤维细胞传代至96孔板，接种100TCID50/孔H1N1流感病毒，在接种流感病毒完成后16h固定，以未感染病毒成纤维细胞为阴性对照，感染流感病毒WT猪成纤维细胞为阳性对照，间接免疫荧光检测结果如图3.2所示。接种流感病毒后16h，未感染流感病毒组无荧光，转基因猪组荧光比例少于非转基因猪和野生型猪组的荧光比例。表明基因组中整合了流感病毒抗性基因的转基因猪尾成纤维细胞能够有效抑制流感病毒基因的表达，从而抑制病毒增殖。图3.2F1代转基因猪体细胞感染16hIFA检测结果（10×）Fig3.2IFAresultsofcellsfromtransgenicswineat16hpost-infectionofSIVA：非转基因猪；B：转基因猪；C：WT猪；D：未感染病毒WT猪3.2.4荧光定量PCR检测流感病毒PB2基因mRNA含量结果猪尾组织成纤维细胞接种流感病毒后，于8h、16h、24h、48h收集细胞，提取总RNA后应@用荧光定量PCR检测病毒PB2基因mRNA拷贝数。经RocheLightCycle480软件分析，pMD-PB2和pMD-actin的扩增结果显示出良好的线性关系，标准曲线的相关系数为0.99，而PB2和β-actin的扩增效率接近2。检测结果如图3.3所示，接种流感病毒后各时间点，将TG猪与NTG、WT猪成纤维细胞内流感基因拷贝数进行统计学分析。将WT猪成纤维细胞内病毒拷贝数设为1，TG猪成纤维细胞内流感病毒基因拷贝数在各时间点都降低，其中感染病毒16h时，TG猪成纤维细胞内流感病毒基因拷贝数降低倍数最高，且差异极显著(P<0.01)，为WT猪的2倍，在8、24、48h时，流感病毒基因拷贝数也有降低且差异显著（P<0.05）。表明转基因猪成纤维细胞基因组中整合的流感病毒抗性基因能有效抑制流感病毒基因组的复制。32 中国农业科学院硕士学位论文第三章体外研究转基因猪抑制流感病毒活性图3.3荧光定量PCR检测流感病毒PB2mRNA的含量Fig3.3VirusPB2mRNAcontentdetectedbyReal-timePCR3.2.5细胞上清病毒滴度测定结果猪尾组织成纤维细胞接种猪瘟病毒后，于8h、16h、24h、48h收集细胞上清，测定病毒的感染滴度，以TCID50计。接种流感病毒后不同时间点，将TG猪的病毒感染滴度与对照进行统计学分析。结果如图3.4所示，与WT猪和NTG猪相比，在各时间点TG猪成纤维细胞上清中病毒滴-2.8度都降低，在16h时TG猪成纤维细胞上清中病毒滴度达到最低，为1×10，差异显著（P<0.05），在8、24和48h时，细胞上清中病毒滴度也降低，差异不明显。结果表明TG猪成纤维细胞基因组中整合的流感病毒抗性基因能有效抑制流感病毒的增殖。图3.4细胞上清中病毒滴度测定Fig3.4Virustitrationfromcultureofthecelllines3.3讨论猪流感是由正粘病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒引起的猪呼吸道疾病。目前，猪流感已遍布美洲、亚洲、欧洲和非洲等地，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的群发性疾病，给养猪33 中国农业科学院硕士学位论文第三章体外研究转基因猪抑制流感病毒活性业带来巨大经济损失。猪流感病毒不仅危害猪群，而且可引起禽类流感和人流感的发生。所以，研究猪流感具有重要的公共卫生意义。A型流感病毒容易发生抗原变异，且主要以两种形式出现：一种是因为病毒基因发生点突变引起的抗原漂移，另一种是由于两种不同流感病毒共同感染一个细胞而发生基因重配，产生新的病毒亚型，从而导致病毒蛋白的抗原性发生变化，后者因为病毒抗原性发生较大改变而称之为抗原转变。抗原漂移与抗原转变都会改变病毒表面蛋白抗原性，主要影响流感病毒血凝素为主，其次是神经氨酸酶（VijaykrishnaDetal.，2011）。在体内和体外的研究中，都表明猪是A型流感病毒进行基因重组的温和宿主，在其体内存在α-2，6唾液酸受体和α-2，3唾液酸受体，能够促进其他流感病毒基因进行重组而进化新病毒株。这些“新”流感毒株产生后能够感染的猪、人类和禽类（Zhangetal.，2009）。通过系统发育和流行病学分析以及分子生物学研究，都证实在猪宿主细胞内有通过不同的父母病毒基因重组而产生的新病毒存在（Quanetal.，2014）。所以，猪的诸多生物特性使其成为流感病毒的“混合器”，促进了流感病毒的进化和传播（NelsonMetal.，2012）。因此，我们制备具有抑制流感病毒活性的转基因猪，从遗传性状上改变其抗病能力，提高机体免疫力，不仅能够减轻了猪流感爆发对养猪业造成的的经济损失，还降低流感病毒突变株的产生，具有重要的公共卫生学意义。利用RNAi技术可以在细胞水平或者小鼠体内抑制禽流感病毒的复制。Ge等（2003）靶向A型流感病毒基因组保守区段设计了特异性的siRNA，在MDCK细胞系和鸡胚中都能有效地抑制流感病毒的产生，而且针对流感病毒NP和PA基因设计的siRNA在清除相应基因时，还能抑制其它病毒的聚积；Zhou等（2008）证实靶向H5N1亚型流感病毒基因组NP、PA、PB1基因所设计的siRNA在MDCK细胞上和鸡胚中都能抑制病毒产生；而且在BALB/c小鼠体内也显示出了明显的抑制流感病毒复制效果；2010年，Wu等针对2009年出现的新型H1N1流感病毒，设计了靶向其保守区域的10个siRNA，在细胞水平证实了其具有抑制流感病毒复制活性（Wuetal.，2010）；Roopali等（2012）利用RNAi技术，针对流感病毒NS1mRNA设计合成siRNA，证实在MDCK细胞上其抑制效率达到60%，在BALB/c小鼠肺中病毒量降低92%；目前，还没有利用RNAi技术生产抗流感病毒转基因猪研究的报道，本研究组利用RNAi技术设计靶向流感病毒保守基因的siRNA和shRNA，构建慢病毒重组载体后，在细胞水平和小鼠体内都已证实其具有抑制流感病毒的作用。本研究在制备获得表达多基因转基因猪的基础上，筛选出阳性转基因猪，并繁育至F1代，证实F1代转基因猪成纤维细胞具有抑制流感病毒的能力。Mx蛋白最早是作为一种抗流感病毒蛋白被发现的，不同种属的Mx蛋白几乎都能够抑制流感病毒的复制。研究发现，当表达Mx蛋白的细胞受到流感病毒感染时，在病毒复制的整个过程中，流感病毒基因mRNA并不减少，但是其蛋白质的合成和基因组扩增都受到抑制（DittmannJetal.，2008）。Palm等将Mx1基因转入细胞内，在细胞水平证实了Mx1能够阻断细胞内吞流感病毒的作用，从而抑制流感病毒在细胞内复制（Palmetal.，2010）。Quan等(2014)将Mx1基因转入猪体内制备了能够过表达Mx1基因的转基因猪，分离培养其耳尖成纤维细胞，在原代细胞水平评价了其抑制流感病毒活性，证实了Mx1基因能够提供转基因猪细胞抵抗病毒的能力。我们将Mx基因与利用RNAi技术设计的靶向流感病毒保守基因的siRNA和shRNA进行串联，制备了能同时表达这三个基因的转基因猪，使其发挥协同作用，产生更强的抑制流感病毒复制的能力。利用将Mx基因导入畜禽体内使其产生免疫抵抗力，不仅能减少流感等疾病的传播，降低其对畜34 中国农业科学院硕士学位论文第三章体外研究转基因猪抑制流感病毒活性禽养殖业带来的危害，还能带动畜牧业的发展，提高整体的经济效益。多个抗病基因联合表达发挥功能的研究是具有很好应用前景的多基因协同抗病策略。2003年，许立华等人将流感病毒HA基因与猪繁殖与呼吸综合征病毒的N基因联合表达，联合表达产物中血凝素(HA)与HA单抗可以特异性结合，进而在此基础上建立乳胶凝集试验，提高了反应的特异性和灵敏性（陈立华，2003）。Dus等（2004）将口蹄疫病毒编码结构蛋白的P1基因和编码蛋白酶的3C基因共同作为免疫原导入苜猜来生产转基因植株，用该转基因植物免疫小鼠后，产生了特异性抗体且能抵抗强毒的攻击。ZhengM等将口蹄疫病毒蛋白酶3C基因和O/NY00衣壳蛋白P1插入鸡痘病毒载体，构建了重组鸡痘病毒VUTAL3CP1，表达产物免疫小鼠和膝鼠后，重组鸡痘病毒可以诱导小鼠和部分膝鼠产生明显的体液免疫和细胞免疫反应。陈红英等（2010）探索鸡新城疫病毒F蛋白免疫原性和鸡白细胞介素-18(IL-18)免疫增强作用，结果证明了质粒pcDNA-F与pIL-18联合免疫能够显著提高鸡的细胞免疫能力，且能够提供50%免疫保护，为NDV的防治开辟了新途径。由此可知，不同的抗病毒功能基因联合之后在抗病作用上起协同作用，从而提高抗病能力。因此我们选择抑制流感病毒复制能Mx基因与靶向流感病毒保守基因的siRNA和shRNA基因进行串联，以期获得更高的抑制流感病毒复制效率。为进一步研究所获得转基因猪成纤维细胞抑制流感病毒复制能力，采用胶原酶结合机械剪法制备了F1代转基因猪的尾组织成纤维细胞，分离培养后进行传代，100TCID50H1N1病毒感染后，通过IFA、Real-timePCR检测H1N1PB2拷贝数及病毒滴度测定方法在体外评价转基因猪成纤维细胞抑制流感病毒复制的活性。与WT猪和非转基因猪相比，感染H1N1流感病毒的转基因猪成纤维细胞内和细胞上清中病毒含量降低，H1N1PB2基因复制效率也显著降低。表明表达多基因转基因猪在细胞水平上具有抑制流感病毒复制的能力，为进一步在动物水平上评价转基因猪抑制流感病毒复制能力奠定了基础，为多基因协同抗病毒研究提供了思路。35 中国农业科学院硕士学位论文第四章全文结论第四章全文结论1、在前期研究工作基础上，本研究成功构建重组慢病毒表达载体，利用体细胞核移植技术制备了F0代克隆猪，通过PCR、RT-PCR、Southernblot、Westernblot方法，证明了F0代转基因猪有外源基因的整合、表达；2、经过遗传繁育和分子生物学、免疫学检测证明了外源基因稳定遗传至F1代；3、猪流感病毒感染F1代转基因猪成纤维细胞，在体外证明了表达多基因转基因猪抑制了流感病毒复制；为多基因协同抗流感病毒研究奠定了基础。36 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢时光如梭，不知不觉中三年的硕士生活已接近尾声，在此期间我收获颇多，感触颇多。借此机会，我要向所有曾经给我帮助和鼓励的老师、同学和亲人们表示感谢！感谢我的导师—孟庆文副研究员！在整个研究生阶段孟老师严谨的科学态度和以身作则的精神深深地影响着我，每当在实验上遇到挫折时，孟老师都会给予我悉心的指导和无私的帮助；同时，孟老师为人和善，心地善良，非常感谢孟老师在生活上给我的无微不至的关怀！在为人处世、遵规守矩、党性原则方面，孟老师也为我指点迷津，我相信，在以后的工作和生活中会给我非常大的启发和积极的影响。在此，我谨向孟老师表示这微不足道的谢意！非常感谢本实验室王伟老师，王老师谦和的性格与热情的待人方式，以及积极乐观的生活态度给了我生活上的很大启示，在实验过程中给予我非常耐心的指导，在学位论文写作与修改过程中付出了很多心血，在此，我向他表示我非常真挚的感谢！感谢哈尔滨兽医研究所，感谢实验动物与比较医学团队，为我提供优越的实验条件和良好的学习机会。感谢本团队陈洪岩研究员、韩凌霞副研究员、廉传江老师、文辉强老师和高彩霞对本研究所给予的宝贵专业意见与建议，使我的实验得以顺利完成。感谢实验室的师兄师姐尹海畅、赵颖慧，李越等；师弟庞中兵；我的同门周长良同学，感谢他们在实验中给予的指导和帮助。尤其要感谢我的朋友马月、刘素丽、佟杰、张晓娜、刘兵、任建乐、王念、牛军伟和周跃辉，三年来你们的陪伴让我感觉到有家的温暖，谢谢你们在我迷茫时所给予的开导与安慰和生活上的关心！特别感谢我的家人，我最亲最爱的人！在我研究生阶段，你们一直默默的做我最坚强的后盾与避风的港湾，谢谢你们给我的全方面关心和无时无刻地支持！44 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历臧凤霞，女，中共党员，汉族，于1988年5月10日出生，山东省高密市人。2008.07-2012.09，就读于山东农业大学动植物检疫（动检方向）专业，于2012年7月获得理学学士学位；2012.9-2015.07就读于中国农业科学院，在哈尔滨兽医研究所进行硕士课题研究。发表文章：臧凤霞，张雅春，王伟，孟庆文等.鸭RIG-I蛋白C端helicase结构域和RD结构域的原核表达及其单克隆抗体的制备[J].中国家禽，2014，36（20）：17-21赵颖慧，王伟，李越，周长良，臧凤霞，孟庆文，陈洪岩，1.1kb、2.7kb、3.0kb鸡输卵管组织特异性启动子的克隆及细胞评价，中国家禽，2014，36（9）：6-11；李越，王伟，赵颖慧，周长良，臧凤霞，冉多良，孟庆文，陈洪岩，核酸免疫制备抗猪流感病毒HA单克隆抗体，中国畜牧兽医，2014，41（7）：35-39；周长良，张雅春，王伟，李越，赵颖慧，臧凤霞，冉多良，孟庆文，陈洪岩，鸭维甲酸诱导蛋白Ⅰ基因原核表达和单克隆抗体的制备及鉴定，中国畜牧兽医，2014，41（9）：20-24；45