猪胚胎体外培养影响因素研究分析

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1、...页眉猪胚胎体外培养影响因素的研究综述摘要：本研究以孤雌激活胚胎为研究对象，对猪胚胎体外培养过程中的相关影响因素进行了探讨。体外成熟的猪卵母细胞经孤雌激活后，用添加.05%BSA的NCSU一23培养的囊胚率(36.7%)极显著高于添加5%，10%和15%FCS的NCSU一23(11.8%，18.5%和10.3%，P<0.01)。在NCSU一23中添加一定比例的TCM一199(10%，25%和50%)，虽然对猪卯母细胞孤雌激活后的分裂率无显著影响(89.6%vs87.0%，83.4%和82.6%，P>0.05)，但囊胚发育率随着TCM1

2、99比例的增加而显著下降(30.1%vs25.0%，11.1%和1.1%，P<0.05)。将NCSU23中的亚牛磺酸浓度从原来的5mmo比降低到.25，1.0或.05mmol几时，对猪卵母细胞激活后的分裂率和囊胚发育率均无显著影响(介.005)，但完全去掉亚牛磺酸则导致囊胚发育率极显著下降(l.4%)。在猪卵母细胞激活后的0币oh添加.034mmol几丙酮酸钠和.54mmol几乳酸钠，显著提高卵母细胞的分裂率(71.0%vs63.9%，P<0.05)，但60h后在培养液中添加丙酮酸钠和乳酸钠则极显著降低其囊胚发育率(3.0，.63，.33

3、%vs20.2%，

4、发育过程均有促进作用。(5)山梨醇对猪胚胎的体外发育可能具有促进作用，但其效果有待进一步验证。关键词:猪胚胎；体外培养；分裂率；囊胚率1前言人们致力于猪胚胎体外生产的研究至少超过了30年且在不断的发展与进步中[1-3]。长期以来,大量的研究试图通过改善培养系统来提高体外胚胎生产效率,努力提高整个生产系统各个环节的技术水平[2,4-5],然而进展不大,目前猪体外成熟(IVM)/体外受精(IVF)/体外培养(IVC)....页脚...页眉的总体效率仍然较低。卵子的体外成熟和胚胎培养是这一技术的重要环节,提高这些环节的技术水平对提高整个体外生产

5、体系的效率尤为重要。因此,本研究拟以猪孤雌激活胚胎为研究对象,着重探讨猪胚胎体外培养过程的相关影响因素,以便建立一套有效的猪胚胎体外培养系统。2材料与方法2.1试剂及药品TCM-199,Gibco公司生产;犊牛血清(FCS),Hyclone公司生产;人绒毛膜促性腺激素(hCG),宁波激素制品厂生产。除特别注明外,其他所有无机盐和生物化学试剂均为Sigma公司生产。卵巢保存及运输液:含有K+、Ca2+、Mg2+的生理盐水。洗卵液:TCM-199+2%发情牛血清(OCS)。成熟液:NCSU-23基础液+10%卵泡液(PPF)+半胱胺酸+激素。

6、胚胎培养液:NCSU-23基础液+0.5%牛血清白蛋白(BSA)。以上配制的所有试剂均用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤消毒。2.2卵母细胞的采集与成熟培养从屠宰场收集青年母猪卵巢,将其置于含有30～35℃生理盐水的保温瓶内,在短时间内送回实验室;然后用10mL注射器和12号针头穿刺抽吸卵巢上面3～8mm卵泡内的卵母细胞,在体视显微镜下挑选出具有完整卵丘细胞层或部分致密卵丘细胞的卵母细胞,用洗卵液清洗2次,放入已装有1.5mL含有激素(10U/mLhCG,0.1μg/mLFSH)的成熟培养液(无血清的NCSU-23基础液+10%PFF+1

7、0ng/mLEGF+0.1mg/mL半胱胺酸)的玻璃培养皿(每皿200～300枚)中,在38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中体外成熟培养20～22h,然后转移到不含激素的成熟液中再培养22～24h。2.3血清的制备用无菌针头和离心管在发情当天的母牛颈静脉处采血,静置30min;在4℃冰箱中放置24h左右,待血清全部析出后,以3500r/min离心10min;吸取血清,再以同一转速离心10min;弃去沉淀,将血清在56℃水浴中灭活30min;最后将灭活的血清过滤消毒,分装,-20℃保存(使用时取出解冻)。2.4卵泡液的制备从卵巢表面3

8、～8mm的卵泡中抽取卵泡液收集于离心管中,3500r/min离心10min;弃去沉淀,直接用0.22μm的滤器过滤灭菌,然后小剂量分装,于-20℃保存,备用。....页脚...页眉2.5卵母细