猪卵母细胞体外成熟的影响因素

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猪卵母细胞体外成熟的影响因素第3O卷第3期2011年6月华中农业大学JournalofHuazhongAgriculturalUniversityVo1.3ONo.3June2qlt,280~284猪卵母细胞体外成熟的影响因素华再东郑新民魏庆信许厚强刘西梅李莉1.贵州大学动物科学学院/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵阳550025;2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室,武汉430064摘要通过采集屠宰场废弃猪卵巢,体外分离和培养猪卵母细胞,探讨基础培养基,激素,卵泡直径大小及卵丘细胞层数对猪卵母细胞体外成熟的影响.结果表明:改良TCM199(mTCM199)较NCSU-Z3培养猪卵母细胞成熟率显着提高(P<0.05);基础培养基中添加PMSG,hcG和pFF,卵母细胞体外成熟率(80.63%)显着高于仅添加其中一种;从卵泡直径3～6mm和大于6mm卵泡获得的卵丘卵母细胞复合体(COCs),其体外培养成熟率(83.33和76.43)极显着高于卵泡直径在3mm以下获得的COCs成熟率(30.94);根据卵丘细胞层数把COCs分为A,B,C3级,其中A级和B级卵母细胞成熟率差异不显着,但都极显着高于C级卵母细胞的成熟率.关键词猪;卵母细胞;体外成熟;卵丘卵母细胞复合体中图分类号S814.8文献标识码A文章编号1000—2421(2011)03—0280—05 猪体细胞核移植(SCNT)以及孤雌激活(PA)等现代胚胎生物技术为开展抗病育种,提高肉质,生产转基因或者基因组修饰猪,建立人类疾病模型以及生物学基础研究诸多方面的探索提供了强大的技术支撑.而猪卵母细胞体外成熟(IVM)是体外受精技术(IVF),胞浆单精子注射(ICSI)和SCNT技术等成功与否的关键L1].相对猪体内成熟的卵母细胞来说,IVM的卵母细胞来源丰富,价格低廉,因而已成为IVF,SCNT研究的主流.在克隆胚的发育能力上,体内成熟的卵母细胞要优于体外成熟的卵母细胞,成功率高L2乇].如何优化猪卵母细胞体外成熟体系,使得卵母细胞核,质同步成熟,获得较强的发育能力,成为当今亟需解决的问题L4].然而,猪卵母细胞的成熟是一个复杂的生理过程L5],主要包括细胞核和细胞质的变化,同时又是一个受多因素调节的过程,严格依赖其生长的卵泡环境_6].本试验旨在通过研究猪卵母细胞体外成熟的主要影响因素,旨在为体细胞核移植提供大量优质的第2次减数分裂中期(M1I)卵母细胞提供基础资料.1材料与方法1.1材料洗卵液(DPBS)购自Gibco公司,孕马血清促性腺激素(PMSG),人绒毛膜促性腺激素(hCG)是宁波激素制品厂生产,其他试剂如未特别注明,均购自Sigma公司(St.Louse,MO,USA).卵母细胞体外培养基为改良TCM199 (mT(l99),其成分为3.05mmol/L葡萄糖,0.91mmol/L丙酮酸钠,0.57mmol/g工,半胱氨酸,lmmol/IL.谷氨酰胺,10ng/mL表皮生长因子(肼),10IU/mLhCG,10IU/mLPMSG,75t~g/mI庸霉素,50t~g/mL硫酸链霉素,10pFF;NCSU-23E;DPBS;脱卵液(0.1%透明质酸酶的DPBS).1.2方法1)猪卵母细胞的采集和体外成熟培养.猪卵巢采自当地屠宰场,置于盛有28~37℃生理盐水(分别含青,链霉素20万IU/L和15万IU/L)的保温收稿13期:2011-03—31基金项目:国家生物新品种培育专项(2008ZXO8006—002;2008ZX08006—003;2008ZX08010—003;2008ZX08011-004;2009ZX08011—030B);国际合作项目(2009BFA012)华再东,博士研究生.研究方向:细胞分子生物学.E-mail:huazaidong123@yahoo.corn.cn通讯作者:许厚强,教授.研究方向:动物生物技术.E-mail:houqiang0524@yahoo.corn;郑新民,研究员.研究方向:动物生物技术.Email:anbit20@163.COrn第3期华再东等:猪卵母细胞体外成熟的影响因素281瓶内,2h内送回实验室,用适量生理盐水(28～37℃)冲洗3～5遍,采用10mL注射器(16号针头)抽吸卵泡,卵泡液置于37℃水浴保温的5OmL离心管中,静置15~20min,弃上清液,实体显微镜下观察,捡取卵丘卵母细胞复合体(COCs),转移到DPBS液滴中,冲洗3遍,再用IVM培养基洗涤3～5遍.卵母细胞的成熟培养采用微滴法_8],于39℃, 100湿度,5CO2培养箱中培养44h后于倒置显微镜下观察卵丘细胞扩散状态,将扩散良好的卵母细胞移人0.1的透明质酸酶中,反复吹打去除颗粒细胞,用DPBS洗卵液清洗2～3次,统计排出第一极体的卵母细胞数量,计算卵母细胞的成熟率(图1,图2).图1成熟卵丘一卵母细胞复合体FiglOtrnulus-oocytecomplexes图2去掉颗粒细胞的卵母细胞Fig.2Matureoocyteremovedgranulosacells2)猪卵泡液(pFF)制备.抽取卵巢上3～8mm直径的卵泡,将抽取液放入离心管中离心(1600r/min)20min,取上清液于超净工作台内,以0.22"m滤膜过滤后分装于0.5mL离心管中,一20℃冷冻保存备用.1.3试验设计与数据分析1)试验1:mTCM199和NCSU一23两种培养基对猪卵母细胞体外成熟效果的比较.将C0Cs分别培养在mTCM199和NCSU-23培养基中,44h后统计排出第一极体的卵母细胞数量,计算卵母细胞的成熟率.同时制备pFF,为后续实验所用.2)实验2:基础培养基中添加PMSG,hCG和pFF对卵母细胞体外成熟的效果的比较.将C0Cs分成4组进行,第1组在mTCM199中添加1OIU/mLPMSG,第2组添加10IU/mLhCG,第3组添加1OpFF,第4组以上3种物质都添加.体外培养44h后比较其成熟率.3)实验3:不同卵泡直径获得C0Cs在体外培养 的成熟率的比较.分别抽吸直径为3～6ITI1TI,大于6rnl'fi和3mm以下卵泡,将C0CS分别培养在m1℃Ml99+10IU/mLPMSG+10~U/mLhOG+10pFF中,44h后观察卵母细胞的成熟率.4)实验4:卵丘细胞的层数对卵母细胞体外成熟率的比较.根据包裹卵丘细胞层数将卵母细胞分A,B,C(A级:包裹5层以上卵丘细胞,B级:包裹3～5层卵丘细胞,C:包裹3层以下卵丘细胞)3级,将获得的COCs培养在mTCM199+10IU/mLPMSG+10IU/mLhCG+10pFF中,44h后比较其成熟率.试验结果用卡方(X2)检验,进行差异显着性分析.2结果与分析2.12种基础培养基对卵母细胞体外成熟的影响从表1可以看出,使用mTCM199培养的卵母细胞成熟率(72.299/6)显着高于NCSU-23(67.50,P<0.05).结果显示mTCM199更适于猪卵母细胞的体外成熟培养,将其作为后续实验的基础培养基.表1mTOM199和NCSU-232种培养基对猪卵母细胞体外成熟效果的比较'TabIe1Effectofdifferentc~turemediumofCOOsoilinvitromatureofoocytes1)同列数据字母相同者表示差异不显着(P>O.05);不同小写字母者表示差异显着(P<O.05),括号中数字为重复次数;下表同.Withinthesamecolumn,thesamevalutesarenotsig—nificantlydifferent(P>O.05);valueswithdifferentsuper—scriptsaresignificantlydifferent(P<O.05).Numberinpa—renthesesshowstherepetitivetimes.Thesameasbelow. 282华中农业大学第3O卷2.2PMSG,hCG及pFF对猪卵母细胞体外成熟的影响从表2可以看出,在基础培养基中仅添加PMSG,hCG或pFF,其卵母细胞体外成熟率明显低于m1℃M199+1OIU/mLPMSG+10IU/mLhOG+lOpFF组(P<0.05),表明PMSG,hCG和pFF在猪卵母细胞体外成熟过程中是非常必要的.表2基础培养基中添加不同激素对卵母细胞体外成熟的影响Table2Effectofdifferenthormonescompositioninculturemedianl0ninvitromatureofoocytes2.3卵泡直径大小对卵母细胞体外成熟的影响从表3可以看出试验组工(>6mm)获得的卵母细胞体外成熟率最高,但与试验组Ⅱ(3～6mm)差异不显着(P>O.05),二者与试验组HI(<3mm)的成熟率差异极显着(P<0.01).表3卵泡直径大小对猪卵母细胞体外成熟的影响Table3Effectofdifferentsizeoffollideoilinvitromatureofacolytes1)同列数据字母相同者表示差异不显着(P>O.05);大写字母不同者表示差异显着(P<O.01),下表同.Withinthesamecolumn,thes~-flevalutesarenotsignificantlydifferent(P~0.05);valueswithdif-ferentlettersareverysignificantlydifferent(P<O.01).ThesalTleasbelow.2.4卵丘细胞包裹层数对猪卵母细胞成熟的影响从表4结果可见,A级与C级卵丘扩展率差异显着(P<0.05),A级和B级在极体排出率上极显着高于c级(P<O.O1),说明包裹3层以上卵丘 颗粒细胞的卵母细胞更适合体外培养,成熟率更高.表4O00S分级对猪卵母细胞成熟的影响Table4EffectofdifferentgradeofCOCsoninvitromatureofoocytes3讨论mTCM199和NCSU-23是当前应用最广,也是猪卵母细胞体外培养最有效的2种基础培养基L9].本试验采用mTCM199和NCSU-23培养基,结果发现前者培养卵母细胞的成熟率显着高于后者.该结果和潘登科等人[10]的研究不一致;但与王海等人[11j和徐小明等人[12]的相同.本试验结果表明,使用NCSU-23为培养基的猪卵母细胞体外成熟效果较差,究其原因可能是因为NCSU-23配方相对复杂,称量产生误差,溶液配比中缺乏蛋白质组分,不能完全提供卵母细胞成熟过程所需的营养成分,从而不能使卵母细胞核成熟的缘故.促性腺激素在卵母细胞成熟启动中发挥重要作用,PMSG和hCG是成熟培养基中使用较多的促性腺激素.在mTCM199+10IU/mLPMSG+10IU/mLhCG+10pFF组卵母细胞体外成熟率显着高于其他3组,说明激素和pFF对卵母细胞体外成熟有促进作用.有些研究者认为猪卵母细胞体外培养的前24h添加PMSG和hCG,后24h去除所有激素,不仅能提高卵母细胞的成熟率,而且成熟卵母细胞的质量也高,受精和发育更正常I1.本研究结果表明PMSG和hCG试验组的卵母细胞体外培养成熟率要显着高于不含PMSG或者hCG组,表明促性腺激素对卵母细胞体外成熟培养是非常必要的. pFF的成分极为复杂,含有大量来自血清的生化因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子.有关pFF对猪卵母细胞成熟及发育的影响,不同学者报道的结果不太一致[14-15],可能与pFF所含的因子随第3期华再东等:猪卵母细胞体外成熟的影响因素283机体内分泌状态的变化而变化有关.此外有报道认为从不同直径卵泡获得的卵泡液也影响卵母细胞的核成熟和发育[1.因此不同批次制备的卵泡液对猪卵母细胞成熟效果也可能不稳定,所以本试验使用来自于同一批制备的pFF,发现母细胞的体外成熟系统中添加l0卵泡液对卵丘细胞的扩散,卵母细胞的成熟具有良好的作用.猪卵母细胞的体外成熟与COCs的卵泡大小有关.卵巢上卵泡在体内正常的生理条件下,是卵母细胞发生,生长和最后成熟的微环境.卵泡的发育调节着卵母细胞的成熟,卵泡发育早期的卵母细胞不具备恢复减数分裂的能力.随着卵泡的发育,当其直径增加到一定大小时,卵母细胞才具备这种能力.根据相关研究,猪卵泡直径只有达到2mlTl以上,其卵母细胞才具备体外成熟的能力,小卵泡中的卵母细胞缺乏进一步发育所需的相关因子[1.本试验结果显示,在猪卵母细胞体外成熟中,卵泡直径3～6mm和大于61Tim的卵泡获得的COCs体外培养成熟率极显着高于卵泡直径在3mill以下COCs的成熟率,大卵泡与中等卵泡获得的卵母细胞体外成熟率无显着差异;小卵泡获得的卵母细胞体外成熟率较低,不适合于体外成熟培养.对不同分级的猪卵母细胞体外培养,A级与B级成熟率无显着差异,但明显高于C级,说明COCs 中卵丘层对卵母细胞成熟有明显影响,A级与B级卵母细胞更适合体外培养,且成熟率更高.有研究报道,猪卵母细胞的体外成熟伴随卵丘细胞的扩散,扩散的卵丘细胞能够调节诸如氨基酸,核苷酸,磷脂酸,激素,蛋白质等物质在卵母细胞内外的进出,诱导卵母细胞排出有害因子,从而有效地抑制卵母细胞的退化[]8-19].卵母细胞在生长发育中所释放的生长因子对卵丘细胞的生长也有一定的促进作用,卵母细胞与卵丘细胞的这种相互作用使得两者共同发育生长,最终促进了卵母细胞的成熟.[1][2]参考文献IEEMS,KANGSK,IEEBC,etal_Thebeneficialeffectsofjnsulinandmetforminoninvitrodevelopmentalpotentialofporcineoocytesandembryos[J].BiologyofReproduction,2005,73(6):1264—1268.0NISHIA,IWAM0ToM,AKITAT.eta1.Pigcloningbymicroinjectionoffetalfibroblastnuclei[J].Science,2000,289:1188—1190.[3]POLEJAEVAIA,CHENSH,VAUGHTTD,eta1.C1onedpigsproducedbynucleartransferfromadultsomaticcells[J].Nature,2000,407:86—90.E43NIEMANNH,RATHD,WRENZYCKIC.Advancesinbio—technology:newtoolsinfuturepigproductionfo?agricultureandbiomedicine[J].ReprodDomestAnita,2003,38(2):82—89.[53霍道坦,陶勇,王勇,等.猪胎儿卵母细胞发生早期的细胞凋亡变化EJ].华中农业大学,2010,29(1):71—74. 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