犬流感病毒的生物学特性研究

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1、犬流感病毒的生物学特性研究陈坚曹穗兰指导老师：贺东生华南农业大学兽医学院摘要:从广州市各宠物匡院采集得忠病犬只的员咽拭子样本，经SPF鸡胚培养分离鉴定，分离出3株疑似犬流感病毒，阳性分离株第三代血凝活性均达128:1以上，而且均不被新城疫阳性血淸所凝集，与H3和H9亚型标准血淸血凝抑制价为&1，与H5型标准血淸血凝抑制价为256:1，进行红细胞凝集谱测定，其屮两株病毒只能凝集鸡的血球和狗的血球；一株除了可以凝集鸡、狗的血球以外，还可以凝集猫，牛，免的血球。关键词:犬流感病毒;分离鉴定；生物学特性流感病毒属分节段负股KNA病毒，属正黏病毒科，分为A、B、C三型,A型流

2、感病毒可以感染禽、猪、马等多种动物和人，B型流感病毐仅感染人，C型流感病诲感染人和猪，其中C型流感病诲感染极少引起严軍:疾病，A型禽流感病靑不似感染禽、猪等多种动物和人，还可以感染猪，犬猫等小动物。多种研究证实：流感病毐中控制N和H的基因讨以发生重组，各种流感病莓之间有着密切的联系，讨在特定的动物怙主屮重组成新的变异毒株，并引发跨物种传播，进而感染人类，威胁人类的生命安全,而在当前，犬作为一种常见的家养宠物，与人类的接触十分的密切，故而，对犬流感病毒的研究极具意义。R前，国外对犬流感病毒的研究已经较为成熟，但国内对犬流感病毐的研究却非常少，病诲分离非常凼难，分离率很

3、低，从而极大地影响了对流感病毒进一少的科学研究。针对这种情况，我们在前期创新研究犬流感分离工作的基础上，继续进行犬流感病毒的分离鉴定工作，井对其进行血淸型鉴定、红细胞凝集谱等生物学特性的研究，现报告如下。1材料准备1.1样品采集疑似流感发病犬只样品的采集：2005年4J]-2006年3月，从广州的部分宠物医院对疑似犬流感病例进行鼻咽拭了•的采樂，早期的釆集对象以出现呼吸道症状的犬H为主，P期根据国外对犬流感的报道研究，针对具杏典型流感症状的犬只进行采样，主要判断治标为：呼吸道症状，低烧，流涕，抗生素治疗无效等。先后采集鼻咽拭子一井份，采得的拭子放入含2500单位/m

4、l双抗保存液中，放4°C冰箱中备用。1.2病料处理样品取K上清液，按每毫升looo单位的含fi加入青链霉素，进行无歯处理，放于4r冰箱备用。1.310XPBS液的制备氯化钠8.5g，磷酸二氮甲0.68g:氢氧化钠0.15g，溶於100ml水中商压灭菌，十倍稀释。1.4阿氏液制备葡萄糖20.5g,氯化钠4.2g,柠檬酸钠8.0g,柠檬酸().55g，加于1(X)水屮，115°C,15min灭菌，调节PH值至6.8〜7.2之间，4'C保存备用。1.5标准阳性血清和抗原流感病谛H5、H7、H9标准阳性血清和鸡新城疫(ND)标准叩性血清由华南农业大学传染病研究室提供。1.6

5、SPF鸡胚由广东永顺生物制品厂SPF种禽饲养室提供。1.71%鸡红细胞、牛红细胞、兔红细胞、犬红细胞、猫红细胞山华南农业人学传染病实验室提供。所冇红细胞用PBS洗3遍，前两次用1500rpm离心两次，每次5分钟，敁后一次用2000rpm离心10分钊[，将离心得的红细胞一亳升加入100ml阿氏液中，配成1%悬液，置4°C保存待用。2方法2.1病毒分离采用鸡胚接种绒毛尿囊腔接种分离的方法2.119—H日龄SPF鸡胚，由广东永顺生物制品厂提供的SPF种蛋孵化。取上述制备的样品上清液，经绒毛从囊腔接种，每个样品接种一个胚，0.2ml/胚，S37°C温箱屮继续孵。2.12孵育

6、2—4天，每天照胚2次，收留死胚，细菌检査为阴性后转放入4°C冰箱。2.13采集鸡胚的绒毛尿囊液进行血球凝集(HA)试验，其出现血凝活性，则继续传代并测定血凝价。若血凝价为阴性，则转入一20°C冰箱保存。2.14将首次收取的HA未柯血凝活性的鸡胚尿囊液与;R:它首次接种收胚P不表现血凝活性的样品收得的尿褒液得进行随机分组，每5个样品尿囊液一组，将同一组的尿囊液每个取0.4ml混合，55荡，再次接种鸡胚传代，方法Ml上。2.15收取的尿囊液再做HA血球凝集实验，结果仍为阴性者则弃去，如为阳性，则将组内的各个样本分别接种鸡胚继续传代，直到分离得阳性毒株，并测定其血凝价。

7、2.16凡病毒分离阳性者均B于一20°C冰箱內保存用于病毐鉴定。2.2病毒鉴定2.21红细胞凝集(HA)试验将上述各传代鸡胚尿囊液按常规进行血凝性和血凝价测定。2.22与新城疫則性血清进行HI试验，以排除新城疫病毐的对能性。2.23血凝素亚型鉴定分别川H5、H7、H9、ND血淸和Hg标准阳性血濟与阳性分离株的鉍囊液进行HI试验。2.24红细胞凝集谱的测定分别采川鸡、牛、免、犬、猫的1%红细胞悬液对上述各传代鸡胚敁囊液进行血凝性和血凝价的测定。3结果3.1病毒的分离及鉴定3.1.1病毐的分离及初步鉴定:本次试验通过采用将样品接种于SPF鸡脐，收集其尿囊液进行血凝活