猪丹毒丝菌广西分离株生物学特性研究及其基因组生物信息学分析

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1、分类号：S855.1+2单位代码：10193密级：公开学号：2012617硕士学位论文猪丹毒丝菌广西分离株生物学特性研究及其基因组生物信息学分析BiologicalCharacteristicsofErysipelothrixRhusiopathiaeIsolatedfromGuangxiandItsGenomeBioinformaticsAnalysis作者姓名：王力波学位类别：农学硕士专业名称：临床兽医学研究方向：动物传染病诊断与防治指导教师：胡桂学教授吴健敏研究员所在学院：动物科学技术学院2015年6月吉林农业大学硕士学位论文摘要摘要猪丹毒丝菌（Erysip

2、elothrixrhusiopathiae）俗称猪丹毒杆菌或丹毒丝菌，属丹毒丝菌属（Erysipelothrix），是一种纤细的小杆菌，革兰染色阳性，人兽共患病原菌。该菌于1882年被Pasteur首次分离到，1886年Loffler首次精确的描述了引起猪丹毒病的病原。该菌血清型复杂，目前已发现1、1a、2、2a、2b、3～24及N型等26种之多。猪丹毒在我国被认为是一种古老的疫病，上世纪80-90年代猪丹毒与猪肺疫、猪瘟被称为养猪业的三大疾病，曾给我国养猪业带来严重的经济损失。该病已经有二十余年极少见到，几乎处于沉寂状态，临床上基本上没有大面积的发生与流行，成为

3、被从业人员“遗忘”多年的疾病。然而，近年来猪丹毒又时有发生，在我国南方的广西、广东、湖南、四川、福建、江西、湖南、安徽等地日趋活跃，频频爆发，造成不同生长阶段的猪群发病死亡。随着时间的推移，该病有从南向北发展，呈现日趋严重的态势。被“遗忘”多年的猪丹毒疫情突然爆发，让不少养殖户措手不及，造成猪群发生大面积急性感染死亡，损失惨重。因此，对于猪丹毒丝菌的研究再一次引起学者和从业人员的关注与重视。广西兽医研究所自2012年5月至2012年10月，从广西壮族自治区的贵港市、宾阳县、陆川县、巴马县4个地市县送检的疑似猪丹毒病料中，通过细菌分离培养、生理生化特性测定、16Sr

4、DNA序列测定与分析、动物致病性试验、血清型鉴定等系统的鉴定与分析，共分离到12株猪丹毒丝菌。其中，贵港市7株、宾阳县1株、陆川县1株、巴马县3株，分别命名为：Er.GXGG-1、Er.GXGG-2、Er.GXGG-3、Er.GXGG-4、Er.GXGG-5、Er.GXGG-6、Er.GXGG-7、Er.GXBY-1、Er.GXLC-1、Er.GXBM-1、Er.GXBM-2、Er.GXBM-3，血清型均为1a型，能致死小白鼠。按照不同分离地区，选取Er.GXGG-1、Er.GXBY-1、Er.GXLC-1、Er.GXBM-1菌株作为代表菌株，与4株上世纪50年代

5、至80年代猪丹毒丝菌参考菌株（CVCC124、CVCC131、CVCC134、CVCC1246），通过观察菌株的生长形态特征，绘制生长曲线，测定生理生化特性、药物敏感特性、半数致死量（LD50）及疫苗免疫保护作用，同时用PCR方法扩增8株猪丹毒丝菌4个毒力因子的7个毒力基因片段，进行细菌生物学特性的比较研究。结果8株菌表现出一致的形态特征、生长曲线和生理生化特性；LD50结果显示，新近分离到的4株菌半数致死量高于4株参考菌株，表明新近分离菌株毒力有所下降；免疫保护试验结果表明，免疫GC42株活疫苗的昆明小白鼠在注射不同年代的猪丹毒丝菌后仍能保持80%-100%存活

6、；对8株菌进行30种常用抗菌药物的药物敏感试验，结果显示，8株菌对β-内酰胺类、氯霉素类、大环内酯类、硝基呋喃类和双萜类药物仍保持高敏，但对四环素、林可霉素、诺氟沙星敏感性出现差异；4株新近临I吉林农业大学硕士学位论文摘要床分离菌株对上述3种药物的敏感性显著低于4株老菌株，表现为耐药。多数菌株对氨基糖苷类、多肽类、磺胺类、硝基咪唑类、利福霉素家族药物表现为耐药。8株菌均能扩增出4个毒力因子的7个毒力基因片段。毒力基因遗传变异分析表明，与参考菌株相比，新近临床分离菌株毒力基因中仅CPS-A、CPS-C发生变异，而SpaA、Sialidase、CPS-B、RspA、R

7、spB为保守基因，同源性近100%。依据以上实验结果，选取GXBY-1株作为代表菌株，提取其全基因组，利用新一代高通量测序技术IlluminaHiSeq2000平台，对GXBY-1株进行全基因组数据的采集、组装与分析。结果显示，GXBY-1株基因组大小为1888332bp，GC含量36.52%，共2个scaffold，11个contig。基因组序列分析后发现，GXBY-1株的基因组含有1766个基因，总长度为1668564bp，平均长度945bp，占基因组全长的88.36%。串联重复序列共62个，总长为9057bp，占基因组全长的0.4796%。小卫星序列44个，

8、微卫星序列