实验二免疫球蛋白的粗提.ppt

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1、实验一、免疫球蛋白的粗提实验目的：学习免疫球蛋白的粗提方法实践IgG分离纯化过程了解分离纯化抗体的原理多克隆抗体血清含有多种蛋白质组分，不适用于实验室分析、检测应用。根据实验目的不同，可按照不同的方法对有效的抗体成分进行分离、纯化。盐析法原理水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可

2、在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33%（NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。盐析法沉淀抗原的机理材料与试剂配制1．动物血清2．硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O1000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。3．0.01Mol/LpH7.4PBS液A液：0.10Mol/LNaH2P

3、O4液NaH2PO4·2H2O15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/LNa2HPO4液Na2HPO4·12H2O35.80g加H2O至1000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。4．0.50Mol/L的HCl液和0.50Mol/L的NaOH液。5．透析袋（或玻璃纸）。实验步骤1.免疫血清0.5mL↓加0.5mL生理盐水/PBS2.逐滴加入饱和（NH4）2SO41mL（此时为50%饱和度）4℃，静置20min3.↓3000r/min离心20min取沉淀溶于2mL生理盐水/PB

4、S中↓4.逐滴加入饱和（NH4）2SO41mL（此时为33%饱和度）4℃，静置20min↓3000r/min离心20min重复步骤3～5，2次7.取沉淀溶于0.5mL生理盐水中↓装入透析袋透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水/PBS中于4℃透析24h，中间换液数次。取出放于聚乙二醇浓缩10min，取出打开将提取物放于EP管中，-20摄氏度保纯备用。注意事项（1）.盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避免产生气泡。（2）.注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。作业与思考题：1

5、，常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法主要有那几种？各自得到的纯度如何？2，五类免疫球蛋白分离纯化的方法皆相同吗？3，分离纯化IgG时，为什么硫酸铵的饱和度先调至50%，然后调至33%？加入硫酸铵溶液时，为什么要一滴滴地加？IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。⑴区带电泳⑵琼脂双相双扩散鉴定⑶免疫电泳鉴定⑷圆盘电泳鉴定