[精品]组织培养.doc

《[精品]组织培养.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、植物的组织培养广义乂叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人T控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指在培养过程中从备器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。理论基础：植物细胞全能性，指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完報植株的遗传能力。组织培养的步骤：一、培养基配制及灭菌配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基屮所有化学药吊，按照需要£1己配制;二是购买商品的混合好的培养基基木成分粉剂，如MS等。1、配制

2、几种母液(1)配制MS大量元素母液100X配成1L母液，分别称取NH4N03165gKH2PO417gKNO3190gCaCl2•2H2044gMgSO4•7H2037g配好后存放于4°C冰箱中。(2)配制MS微量元素母液100X配成1L母液，依次称取KI0.083gNa2Mo04•2H2O0.025gH3BO30.62gCuSO4•5H200.0025gMnS04•H201.69gCoC12•6H200.0025gZnS04•7H200.86g配好后存放于4°C冰箱屮。(3)配制MS有机母液100X配成1L母液，依次称取肌醇10g盐酸硫胺素

3、(VB1)O.Olg烟酸0.05g甘氨酸0.2g盐酸毗哆醇(VB6)0.05g配好后存放于4°C冰箱屮。(4)配制MS铁盐母液100X配成1L母液，依次称取EDTA二钠3.73gFeS04•7H202.78g配好后存放于4°C冰箱中。激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1半量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1半量的盐酸溶解，然后再加蒸饰水定容。一•般取lOOmg配成100ml母液。2、配制培养基以配置ILMS培养基为例，按顺序进行如下操作：（1）先在烧杯屮放入一些蒸馅水。（2

4、）分别取上而母液倒入。（3）一般称取30只蔗糖倒入，搅拌溶解。（4）加蒸饰水用量筒定溶至1L。（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取,减少误差。（6）用酸度计调整PH至5・7-5・8。可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。1当量NaOH配制：称取NaOH4g配成100ml溶液。（7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉），倒入上而配好的溶液屮（8）无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，

5、用橡皮筋或绳子扎紧。（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。（10）灭菌后从灭菌锅屮取出培养基，倒入灭过菌的培养瓶屮（培养瓶用封口膜封口，用橡皮筋或绳子扎紧），平放在实验台上令其冷却凝固。接种接种吋由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的吋期，这一吋期主要由空气屮的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空问消毒。接种室内保持定期用1%-3%的高猛酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气屮灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行：（1）在接种4小吋前用

6、甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌；（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯;（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；（4）丄工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将银子和剪卫从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等;（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切

7、割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。现将接种前后的程序连贯地介绍。无菌接种步骤：（1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。（2）材料吸干后，一手拿银子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程屮要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基丄。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水

8、平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外而灼烧，去掉棉塞，再烧管口里而。然后用银子夹取一块切好的外植