《生物化学实验》.ppt

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1、《生物化学实验》课程简介生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课，本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技术及典型仪器设备。通过实验有助于学生加深对生物化学的基本知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术。目录实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法(操作性)4学

2、时实验二考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度(操作性)3学时实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳(验证性)5学时实验四动物肝肝脏DNA的分离与鉴定(操作性)3学时实验五血液中葡萄糖的测定(操作性)3学时实验六血清中总胆固醇的测定(操作性)4学时实验七唾液淀粉酶活性的观察(综合性)4学时实验八维生素C的定量测定(操作性)4学时实验九脂肪酸的β-氧化(操作性)4学时实验十琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶(操作性)4学时实验十一酪蛋白的制备(操作性)4学时实验十二肝脏谷丙转氨酶活力测定(综合性)3学时实验一氨基

3、酸的分离鉴定——纸层析法【实验目的】1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性颜色反应。3.学会分析未知样品的氨基酸成分。【实验原理】纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和

4、了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。Rf值的定义为：Rf=(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶剂前沿的距离）用纸层析鉴定样品时，一般都

5、与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。【实验试剂与器材】1、溶剂系统（1）碱相溶剂：正丁醇:12%氨水:95%乙醇＝13:3:3（体积比）（2）酸相溶剂：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比）2、显色贮备液：0.1%水合茚三酮丙酮溶液3、V（0.1%硫酸铜）:V（75%乙醇）=2:38溶液。4、混合氨基酸溶液6mg/ml。5、滤纸。6、烧杯10ml（×1）。7、剪刀。8、层析缸（×2）。9、微量注射器10μl（×1）或毛细管。10、电吹风（

6、×1）。11、722型（或7220型）分光光度计。【实验步骤】1．纸的处理取18cm长、18cm宽的滤纸一张，离底边2cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点(原点)划圈，使圈的直径小于0.5cm。2．点样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点1次。每个样品共点2次。3．层析将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图1)。将培养皿中放

7、入2／3量的展层剂，放入层析缸中，然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点，开始层析。当溶剂前沿到达离上端2cm处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿，晾干。图1滤纸的缝合4．显色用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚三酮，晾干后，将滤纸放入烘箱中(80-100℃)，烘烤5分钟后，滤纸上即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓(见图2)。图2.层析谱1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿5．计算用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基

8、酸的Rf值。【注意事项】(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。(2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。(3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。(4)点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。(5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。实验二考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度【实验目的】学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质--染料结合法的原理，