大田软海绵酸和鳍藻毒素-1纯化样品的分析.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第4期2012年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry539～544DOI：10．3724／SP．J．1096．2012．00741大田软海绵酸和鳍藻毒素一1纯化样品的分析冯振洲，于仁成周名江(中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室，青岛266071)(中国科学院研究生院，北京1000491)摘要采用高效液相色谱一荧光检测、高效液相色谱一紫外检测、流动注射进样一质谱检测和高效液相色谱一质谱联用分析等方法对从

2、有毒利玛原甲藻(ProrocentrumlimaDodge)中分离纯化的大田软海绵酸(OA)和鳍藻毒素一1(DTX1)毒素样品进行定性鉴定和纯度分析，为毒素标准品的制备提供材料和方法依据。通过柱前衍生、HPLC-FLD分析，可在样品中检测到OA和DTX1与4_溴甲基7_甲氧基香豆素(BrMmc)的衍生物，表明样品中存在OA和DTX1毒素。HPLC-UV方法在200am下的检测结果表明，OA和DTX1是样品色谱图中主要的色谱峰，OA样品和DTX1样品纯度可以达到％和98％。根据正、负离子模式下流动注射一

3、质谱分析结果，毒素样品和标准品质谱图中信号最强离子的m／z相同，应为OA和DTX1毒素的[M+Na]和[M—H】_离子，其裂解方式也基本一致。通过HPIC-MS方法，对样品进行了m／2o0～1000的全扫描：分析，发现OA样品中可检测到少量杂质，而DTX1样品中仅检测到DTX1毒素成分。分析结果表明，前期分离纯化的OA和DTX1毒素样品纯度较高，可以在腹泻性贝毒(DSP)毒素液相色谱和液相色谱一质谱联用分析中用作标准毒素。关键词腹泻性贝毒；大田软海绵酸；鳍藻毒素一1；高效液相色谱一质谱联用1引言大田软

4、海绵酸(OA)及其衍生物鳍藻毒素(DTxs)是一类亲脂性聚醚类化合物，主要由鳍藻属和原甲藻属有毒甲藻产生[1]。当有毒微藻被双壳贝类滤食后，OA和DTXs毒素会：芷贝类消化腺内累积。贝类中沾染的OA和DTXs毒素是导致腹泻性贝毒中毒(DSP)的主要毒素成分。食用染毒贝类后，患者会出现腹泻、呕吐等急性中毒症状。研究发现，OA和DTX1引起成人出现中毒症状的最小剂量约为40和36i．tg[4]。除上述急性中毒症状外，OA和DTXs毒素还是蛋白磷酸酶I(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的抑制物[5]，能

5、够影响蛋白磷酸化过程，促进细胞凋亡和肿瘤形成】。其长期毒性效应对贝类养殖业的发展和公众健康构成了严重威胁。香港、深圳、舟山、青岛、烟台、天津等地的海产品中曾检出DSP毒素嘲。对于OA和DTX1等DSP毒素成分，高效液相色谱一荧光检测法(HPLC—FI，D)和高效液相色谱一质谱联用分析法(HPLC—MS)是应用最广的方法[9~11]。HPLC—FLD法是通过毒素成分与衍生剂的反应，将毒素转化成具有荧光活性的衍生物进行检测。蒽重氮甲烷(ADAM)和4_溴甲：基7_甲氧基香豆素(BrM—mc)等荧光衍生剂常

6、用于OA和DTX1的分析。其中，BrMmc衍生法是一种较成熟、在国内应用较多的DSP毒素分析方法卜】。在实际应用中，这些方法都需要有毒素标准品支持。但是，目前毒素标准品价格昂贵，在一定程度上制约着贝类产品质量控制工作的开展。本研究组曾从培养的有毒利玛原甲藻(ProrocentrumlimaDodge)中分离纯化了一定量的OA和DTX1毒素(实验过程另文发表)。在本研究中，通过HPLC—FLD、高效液相色谱一紫外检测法(HPLC—UV)、流动注射进样一质谱检测法和HPLC—MS等方法，对制备的OA和DT

7、X1毒素样品的性质和纯度进行了分析。2实验部分2．1仪器与试剂Waterse2695液相色谱系统(美国沃特世公司)；Esquire离子阱质谱仪(美国布鲁克公司)；Agilent201卜06-13收稿；201卜08-15接受本文系国家高技术研究发展计划项目(863计划，No．2006AA09Z178)、国家自然科学基金项目(No．40676072)和海洋所知识创新领域前沿项目资助‘E-mail：rcyu@qdio．ac．cn540分析化学第4O卷1100高效液相色谱系统(美国安捷伦公司)。OA和DTX1

8、毒素样品(加拿大国家研究院海洋生物科学研究所)用甲醇溶解，一20℃下保存备用；OA和DTX1毒素标准品(日本WAKO公司)，一20℃下保存备用。甲醇、乙腈、丙酮(Merck公司)；甲酸(98％，Fluka公司)；4-溴甲基一7一甲氧基香豆素(BrMmc，>97％)，N，N一二异丙基乙胺(>99％)，购自Sigma-Aldrich公司。自制超纯水。2．2实验方法2．2．1高效液相色谱一荧光检测法取适量毒素样品和标准毒素，置于2mL玻璃样品瓶内，高纯氮气吹干