样品的分离,富集和纯化.pdf

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1、复杂样品的分离、富集和纯化1一、样品前处理的重要性1.样品分析过程•样品采集•样品前处理•分析测定•数据处理和结果报告样品样品分离、富集和纯化分析(分解)(被测物)22.样品前处理的目的感兴趣的某特定化合物浓缩微量的组份的浓度太低，仪器难以提高检测的灵敏度及选检测择性含有颗粒阻塞系统除去微粒有许多干扰色谱分析的减少干扰杂质，改善分化合物离的效果有利于色谱柱及仪器的保护33.样品的前处理重要性†占样品分析时间的比例样品前处理所占整个分析时间~2/3†占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品†实验

2、的重复性及准确性最差的环节影响实验结果好坏的最重要因素是决定性的步骤4二、样品前处理技术分类样品形态样品和杂质的性质目标任务5分类样品形态固态索氏提取微波辅助萃取超临界萃取液态液液萃取固相萃取吹扫捕集气态固体吸附剂法全量空气法6分类状态和性质•固体颗粒离心过滤沉淀•样品和杂质化学性质的差异液液萃取固相提取离子交换蒸馏挥发7三、样品前处理的各种方法方法选择性基础沉淀溶解度液液萃取样品在两相中的分配固相萃取样品在吸附剂上的吸附与分配渗析/超滤分子量与体积电泳电荷/淌度蒸馏/蒸发沸点与蒸气压超临界

3、萃取样品在超临界流体中的分配8生物样品前处理技术被测物在样品基质中提取分析91.蛋白沉淀法在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使样品中的蛋白质沉淀，然后经离心去除步骤：•吸取一定体积血浆•加入适量有机溶剂•高速混合•离心取上清液•以水稀释后进样10特点：简单快速可被自动化，适用于高通量分析若检测限要求不高时较适用属快速但粗糙的净化技术，仅可去除约90-95%的蛋白质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未被去除。分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗导致样品稀释,不适合用于超痕量分析

4、场合进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无内标，分析重现性不佳)112.液液萃取(LiquidLiquidExtraction)根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差异来将分析物从一相提取至另一相中。步骤：有机层水层12特点：装置简单操作容易常被认定为成本低廉费时费力常因乳化效应使相间分层不彻底导致重复性较差消耗大量的有机溶剂。133.固相萃取(SolidPhaseExtraction)依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将其从液相提取至固定相中（本质上为色谱分离方法）Prepar

5、esamplesolutionCondition1mLmethanol/1mLwaterLoadWashEluteEvaporate&reconstitute14（1）特点可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物并浓缩样品分析结果呈高度可靠性使得检测灵敏度和选择性大大提高明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少分析结果的精密度提高(RSD<5%)多样化的产品设计迎合不同样品通量要求15例：SPE的作用（不同提取过程的结果比较）乙腈提取固相萃取16（2）SPE技术

6、—形式和填料类型小柱（cartridge）96孔提取板/Elution提取板（plate）提取柱（on-linecolumn/cartridge）柱体色谱柱床(吸附剂)过滤膜/筛板硅胶（Silica）C/C188插口/出液口MCX/MAX/WAX/WCX17固相提取技术的色谱基础液相色谱如何实现分离？流动相固定相被测物AB被测物BA18如何在反相色谱条件下获得保留？弱极性—非极性固定相（吸附剂）弱极性—水溶性--极性非极性流动相物质AC18-Silica极性物质B19HPLC与SPE的比较HPLCSPE

7、颗粒直径~5µm40-80µm柱床效率highhigh柱外体积lowlow柱长5-30cm~1cm塔板数(N)~10,000<50retentionmechanism.20HPLC与SPE比较－分离效率10.80.60.40.200510152010.8Normalizedconcentration0.60.40.2005101520Elutionvolume(mL)21（3）SPE的一般策略•萃取机制取决于分析物与固相表面的活性基团之间的分子间作用力•目的和作用除去杂质及干扰组分把样品按照不同极性分组富集痕量

8、的组分22SPE的一般策略•洗脱干扰物质，保留目标组分–干扰物质K0–目标组分K值较大•浓缩目标组分–目标组分K值较大，且上样体积大–洗脱被浓缩组分–提高灵敏度•洗脱感兴趣的组分，保留干扰物质–目标组分K0–干扰物质K值较大23（4）固相提取过程的一般步骤•以反相提取为例甲醇和水样品水溶液5%甲醇水溶液甲醇活化及平衡上样清洗洗脱(可选步骤)