环境样品中DNA的分离化和纯化林存刚

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1、环境样品中DNA的分离纯化和文库构建制作：林存刚专业：微生物学号：2003028基因文库genelibrary：将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小的片段，并进行克隆化，包括其中每一种片段的汇总，称为基因文库。为防止用一种限制酶可能切断某个基因，应该用不同限制酶切割建立基因文库。对于一个大的基因组，通常这种基因文库是由霰弹法克隆构建的。根据基因文库的组成，可分为基因组文库和cDNA文库等。基因文库可用于研究基因的结构功能和筛选基因工程的目的基因。分离纯化和文库构建从分子水平上研究微生物的意义分离纯化文库构建研究进展从分子水平上研究微生物的意义传统微生物学发展微

2、生物资源开发利用现代生物技术发展BACK分离纯化样品采集和材料准备分离和纯化DNA浓度测定BACK样品研磨冻融抽提热处理离心抽提去除抑制剂离心TE溶解电洗脱分离纯化酶切要求浓度测定粗制DNA浓度测定：已知DNA的酶切产物与待测DNA一起进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，比较荧光亮度，推测DNA的浓度。纯化DNA的浓度测定：利用DyNAQuant200荧光仪测定。返回文库构建和分析理论基础实施方法评估分析文库构建EcoRI酶切位点富含A/T(或PstI的酶切位点富含G/C），可以用来酶切建库。载体和酶切片段都用同一种酶酶切后，才会具有互补位点，才能连接。噬菌体菌落更容易

3、保存。实施方法EcoRI或PstI对纯化DNA进行酶切琼脂糖电泳分离酶切产物DEAE纤维素滤纸回收3~8kbEcoRI或PstI酶切段载体处理（经EcoRI或PstI酶切和去磷酸化处理）连接连接产物转化大肠杆菌（病毒转染或氯化钙法）蓝白斑筛选重组子培养保存返回策略实施方法评估分析对阳性克隆插入片段进行单向测序去载体部分处理开放阅读框预测BLAST同源性检索分析推测开放阅读框可能编码的功能BACK开放阅读框开放阅读框（ORF,openreadingframe）是一个没有终止编码的密码子序列。在原核基因中，编码区是一个单独的ORF；而真核基因的编码区通常包含几个不相连的O

4、RF（被非编码序列即内含子所分隔）。每条双链DNA有6个潜在的读框（readingframes）或称相位（phase）：一条链沿5’-3’方向有3个读框（forward），称为正向读框；则其互补链沿5’-3’方向的3个读框称为反向读框（reverse）。返回BLAST软件BLAST对一条或多条序列,在一个或多个核酸或蛋白序库中进行比对。同时还能发现具有缺口的可能比对上的序列。共有五种ＢＬＡＳＴ：1.ＢＬＡＳＴＮ（核酸序列到核酸库中的一种查询，库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。）2.ＢＬＡＳＴＰ3.ＴＢＬＡＳＴＮ4.ＴＢＬＡＳＴＸ5.ＢＬＡＳＴ

5、ＸBACK蓝白筛选相关研究进展通过设计PCR引物直接从环境样品DNA中扩增得到已知蛋白类似物的基因。用分子克隆方法从环境样品中直接得到新酶。本实验方法适用于获得对分子操作敏感且能用来高效建库的基因DNA。可以获得相关的新的外源序列。从基因文库中获得完整基因。基于序列同源性或酶活性筛选方法寻找目的基因。谢谢！