实验载体类型与质粒DNA的提取、分离和纯化

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1、实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化1、质粒与载体的基本知识载体（vector）:把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。载体的基本类型：质粒（plasmid）：重组DNA技术中最常见的载体。噬菌体（phage）：Cosmid：BAC(bacterialartificialchromosome)YAC(yeastartificialchromosome)其它质粒的基本性质：质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真

2、菌细胞中，它具有自主的复制和转录系统，但质粒的复制和转录需要宿主细胞编码的某些酶和蛋白质。此外，质粒还具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上。在细胞培养过程中，加适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的20多个扩增至1000-3000个。质粒的不相容性（incompatibility）利用同一复制系统的不同质粒不

3、能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，只有一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的质粒将丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。但利用不同复制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在。质粒载体的基本特性和要求.分子量小、多拷贝、松弛控制型.具有多种常用的限制性内切酶的单切点。.能插入较大的外源DNA片段.具有容易操作的检测表型。pBluescriptSK(+/-)质粒载体（pBS）基本结构:.ColE1origin.Ampicillin.Fiorigin.MC

4、S(多克隆位点).LacZback噬菌体（phage）噬菌体为一种侵染细菌的病毒,病毒颗粒有一个包裹着48.5Kb的线性双链DNA基因组的二十面体的头部,一个长的柔韧的尾部.在感染的细胞内,噬菌体既可以以裂解性的生活周期,也可以是溶原性的生物周期(基因组整合进宿主基因组).病毒颗粒内的基因组是线状的,但它的两端是单链且互补被称作cos末端(cosend,由12bp构成的粘性末端).一旦进入细胞,两个cos末端就会迅速相互结合,形成有缺口的环状基因组,细胞的DNA连接酶可修补该缺口.噬菌体（phage）在48.5Kb的基因组中,中心区域的大部分对侵染裂解都是不必要的,可以

5、被不相关的DNA序列所替换,不过DNA的总长度必须是原长度的75%-105%之间,即37-52kb.考虑到必要区域,可克隆进入噬菌体的DNA片段大约为20kb(最大为23kb)左右.至今已用噬菌体开发出许多插入型和置换型载体插入型载体:ZAP,gt10,gt11等置换型载体:GEM-11,GEM-12,EMBL3,EMBL4等.与一般的质粒载体不同,噬菌体转染前需要利用噬菌体外壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装抽提物)在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒.GEM-11载体（置换型）gt11sfi-Not载体及多克隆位点（插入型）backCo

6、smid利用质粒分子形式,且利用了噬菌体的cos位点的特性.体外将DNA包装入噬菌体颗粒仅要求cos位点在线性DNA上有正确的距离(37-52kb).最原始的Cosmid载体是一个正常的小质粒,包含一个复制起点(ori)、选择性标记及一个cos位点和一个用于克隆的限制性位点.与目的片段DNA连接后,DNA被包装进入噬菌体颗粒.感染后经cos位点配对,DNA重新环化,象正常质粒一样扩增.Cosmid载体图谱back细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)BAC是一些环状DNA分子。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌

7、F因子(致育因子)的严紧型控制的复制子，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶(repE)以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座(para、parB和parC)。将外源基因组DNA片段在体外连接到约7kb的BAC载体上，然后将连接物通过电穿孔的方法导入已鉴定好的大肠杆菌重组缺陷型菌株，就构建成了单拷贝的质粒。第一代BAC载体不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的BAC载体可以通过。互补的原理筛选