大田软海绵酸免疫亲和柱的开发及初步应用

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1、大田软海绵酸免疫亲和柱的开发及初步应用Developmentandpreliminaryapplicationofokadaicacidimmunoaffinitycolumn作者姓名：李琳领域（方向）：兽医指导教师：卢士英副教授类别：兽医硕士论文答辩日期：2015年6月2日本项目由国家自然科学基金（31071539）和大连众信检测技术有限公司合作项目（3D6120016206）资助FundedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(NSFC,NO.31071539)andtheCooperationProgramoftheDali

2、anZhongxinTestingTechnology,LLC.(No.3D6120016206)中文摘要大田软海绵酸免疫亲和柱的开发及初步应用大田软海绵酸(Okadaicacid,OA)是由一些赤潮甲藻类产生的，其毒性对贝类没有什么影响，但如果人类误食了被OA污染的贝类海鲜，常引起腹泻、恶心、呕吐等腹泻性症状，OA虽无强烈的急性毒性，但却有致癌和免疫毒性作用，人类的健康问题受到严重威胁，因此，对该毒素的预防和控制具有重要的公共卫生学意义。在毒素的液相色谱、免疫学等检测方法中，都需要对毒素进行有效的提取，进而真实反应海产食品中的毒素的含量，从而确保食用者的安全，因此建立一种高

3、效、方便、易于操作的样品前处理手段就显得尤为重要。免疫亲和柱作为一种常用的应用于各种检测分析中的前处理手段，具有高效、方便、特异性强等优点，而ELISA方法具有操作简单、结果相对稳定、成本较低等优点，广泛应用于多种食品污染物的快速检测。本研究在获得OA单克隆抗体杂交瘤细胞株的前期工作基础上，自制免疫亲和柱，用来对加标海产样品进行前处理，通过间接竞争ELISA方法，定量分析层析柱的回收率以及应用效果。本论文复苏特异性分泌抗OA的杂交瘤细胞株，通过体内诱生法大量制备小鼠腹水，并运用ProteinG亲和层析柱对腹水进行纯化，成功制备出纯度较高6的OA单克隆抗体，抗体的效价为2.56

4、×10。利用制备的单克隆抗体与CNBr活化的Sepharose4B进行偶联，偶联率可达到93.4%，成功制备了OA免疫亲和柱，并对其进行条件优化，最终确定上样缓冲液为含0.2mol/LNaCl的PBS(pH=7.4)，上样缓冲液的体积为1.5mL，洗涤液为甲醇：水（v/v：1/20），洗脱液为甲醇：水（v/v：9/10），洗脱液体积是1mL。利用制备的免疫亲和柱对贝类样品进行加标回收试验，利用间接竞争ELISA方法检测回收率达90.3%，且应用HPLC-MS/MS方法验证，得到了相似的结果。进一步对10种贝类样品初步进行了OA含量的测定，结果显示7种样品OA阳性，其中栉孔扇贝

5、中OA含量最高为33.91ng/g，毛蚶次之，含量为11.45ng/g，其他样品OA含量均小I于10ng/g。免疫亲和柱的成功制备，可有效富集样品中OA含量，减少基质的影响，从而提高检测准确率，为监测OA污染情况以及建立OA检测方法，提供了高效的前处理工具。关键词：大田软海绵酸，免疫亲和柱，单克隆抗体，ELISA，检测IIAbstractDevelopmentandpreliminaryapplicationofokadaicacidimmunoaffinitycolumnOkadaicacid(OA)isproducedbyRedtidealgaearmor,thistox

6、inhasnotoxiceffectontheshellfishitself,however,whenhumansconsumeshellfishcontaminatedbyOA,Diarrhea,nausea,vomitingdiarrheasymptomswilloccure.Ithasnostrongacutetoxicity,buthasmutagenicandimmunotoxiceffects.Humanhealthisseriouslythreatened,therefore,thepreventionandcontrolofOAhasimportantpubl

7、ichealthsignificance.Inliquidchromatographyandimmunologydetectionmethods,effectiveextractionofthetoxinisnecessaryforevaluatingcontentoftoxinsinseafood.Toensurethesafetyofconsumers,itisnecessarytoestablishefficient,convenientandsimplepretreatmentmethod.Im