复合线性离子阱质谱测定鼠脑组织中神经甾体类化合物.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2015年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry118～1124DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150149高效液相色谱-三重四级杆／复合线性离子阱质谱测定鼠脑组织中神经甾体类化合物刘佳张朦万有吴红海侯艳宁郑乐民¨尹玉新(北京大学系统生物医学研究所，北京100191)(北京大学神经科学研究所，北京100191)(中国人民解放军白求恩国际和平医院药学部，石家庄050082)摘要建立了高效液相色谱一串联质谱法(

2、HPLC—MS／MS)测定鼠脑组织中6种神经甾体类激素(别孕烯醇酮、孕烯醇酮、孕酮、脱氧皮质酮、四氢脱氧皮质酮、去氢表雄酮)的方法。采用AgilentXDB·C色谱柱，以5mmol／L乙酸铵一甲醇为流动相，梯度洗脱分离，在电喷雾正离子模式下，以多反应监测(MRM)扫描模式采集数据，基质匹配内标法定量。孕酮和脱氧皮质酮在0．10～10ng／mL范围内呈良好的线性关系，别孕烯醇酮、孕烯醇酮、四氢脱氧皮质酮、去氢表雄酮在0．50～10ng／mL范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0．99；在0．4，4．0和8．0ng／mL加标水

3、平下的平均回收率为91．2％一115．5％；相对标准偏差(RSD，n：6)为0．87％～8．8％；检出限为0．04～0．20ng／mL，定量限为0．10～0．50ng／mL。关键词神经甾体；液相串联质谱；多重反应监测；鼠脑1引言神经甾体是指在神经系统中合成的甾体和经血脑屏障进入神经系统发挥作用的外周甾体及其代谢衍生物_lj。这些神经甾体可以通过结合不同的神经受体(如GABA，Sigma受体)调控神经功能。神经甾体的行为与中枢神经系统正常功能的行使密切相关。研究表明，在不同的生理和病理条件下，神经甾体在各个脑区中的含量会显著变

4、化2J。神经甾体还会参与焦虑和抑郁的调节过程。由于神经甾体在生物体内含量极低，基质干扰多，使得生物体内内源性神经甾体的测定十分困难，因而开发快速、准确检测生物体内神经甾体含量的方法就显得尤为重要。传统的神经甾体的检测方法有放射免疫标记法(RIA)和气相色谱质谱联用法(GC．MS)[41，但放射免疫标记法特异性差，且存在安全隐患；气相色谱一质谱联用法虽然灵敏度高，但样品前处理步骤复杂，不能实现高通量分析。液相色谱．质谱联用技术由于其选择性好、灵敏度高、适用范围广等优点，近年被广泛应用到神经甾体检测领域¨5j。但这些工作有的需要

5、复杂的衍生化过程J，有的使用多个同位素内标，增加了检测成本¨；有的只检测1～2种待测物，缺乏全面性’“。本研究以大鼠脑组织为基质，建立了高效液相色谱．串联质谱法(HPLC．MS／MS)同时检测脑组织中别孕烯醇酮(AP)、孕烯醇酮(PREG)、孕酮(PROG)、脱氧皮质酮(DOC)、四氢脱氧皮质酮(THDOC)、去氢表雄酮(HEA)6种神经甾体类化合物的方法。本实验采用的高效液相色谱．三重四级杆／复合线性离子阱质谱是一种新型质谱仪，与普通的液相色谱一三重四级杆串联质谱相比，提高了MS／MS扫描能力。本研究以甲基睾酮为内标，较同

6、位素标记物内标方便易得，内源性杂质不干扰测定，提高了方法的准确度和精密度¨。本方法无需衍生化，操作简便、快速，可同时测定大鼠不同脑区中神经甾体的含量，为建立其他生物样本中神经甾体的检测方法提供参考。2实验部分2．1仪器与试剂LC-20AD高效液相色谱(日本岛津公司)；ABSCIEXQTRAP6500质谱仪(美国AB公司)；固相萃2015~2—17收稿；2015_o5-21接受本文系国家自然科学基金项目(No．21305005)资助E—mail：zhengl@bjmu．edu．cn；yinyuxin@b_jmu．edu．cn第

7、8期刘佳等：高效液相色谱一三重四级杆／复合线性离子阱质谱测定鼠脑组织中神经甾体类化合物1119取仪(美国Supelco公司)；固相萃取柱StrataC一E50rag／1mL(美国菲罗门公司)；离心浓缩仪(美国Thermo公司)；0．22m聚丙烯(Polypropylene)膜过滤离心管(美国Coming公司)；Milli．Q超纯水仪(美国Millipore公司)标准品别孕烯醇酮(Allopregnanolone，AP，纯度98％)、孕烯醇酮(Pregnenolone，PREG，纯度98％)、孕酮(Progesterone，P

8、ROG，纯度99％)、脱氧皮质酮(11-Deoxyeortieosterone，DOC，纯度97％)、四氢脱氧皮质酮(Allotetrahydrodoc，THDOC，纯度99．5％)、甲基睾酮(Methyltestosterone，MT，纯度99％)、去氢表雄酮(Dehydroepiand