亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性离子阱质谱测定蛋白食品中L-羟脯氨酸残留.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2011年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl373～l379亲水性相互作用色谱一四极杆串联线性离子阱质谱测定蛋白食品中L一羟脯氨酸残留赵善贞邓晓军彭涛伊雄海郭德华韩丽盛永刚吴巧彬(上海出入境检验检疫局，上海200135)(中国检验检疫科学研究院，北京100025)(上海海洋大学，上海200433)摘要建立了亲水性相互作用色谱一四极杆串联线性离子阱质谱检测含蛋白食品中的皮革水解蛋白标示物L一羟脯氨酸(L—HYP)的同时定性与定量分析方法。样

2、品中的L—HYP经酶解后用乙腈沉淀蛋白，HLB小柱除去部分脂溶性干扰物，采用液相色谱一质谱进行测定。本方法采用IDA结合EPI模式对试样中的L—HYP进行定性分析，并建立LHYP的二级子离子谱库。通过以MRM模式对LHYP进行定量分析，LHYP在12种蛋白食品中平均回收率在73．4％～114．2％(一6)之间，相对标准偏差在2．5％～14．4％(=6)之间，可对试样中的LHYP在定性确证的同时进行定量分析。关键词L一羟脯氨酸；亲水性相互作用色谱；四极杆串联线性离子阱质谱；皮革水解蛋白l引言皮革水解蛋白是利用皮革、皮鞋下脚料及动物毛发，

3、经水解提炼而生成的一种蛋白。由于水解过程中添加重铬酸钾和重铬酸钠等重金属盐，具有潜在的致癌和致畸作用，早在2009年就被列入我国“第二批食品中可能违法添加的非食用物质名单”【l】。不法商贩将皮革水解蛋白添加到乳与含乳食品中，以提高食品的表观蛋白质含量，对相关食品制造行业和消费者身体健康造成的严重威胁。L一羟脯氨酸(L—hydroxyproline，L—HYP，结构式如表1)是组成动物胶原蛋白的特征性氨基酸。检测皮革水解蛋白多以L—HYP为标示检测物，其检测方法主要有比色法、毛细管电泳法、氨基酸分析仪]、液相色谱法及液相色谱／质谱法隅等

4、。已有液相色谱一串联四极杆质谱测定L—HYP的报道均为采用选择离子方式检测，方法灵敏度较低；由于羟脯氨酸极性强，采用反相色谱分离时需要进行衍生，方法繁琐，并且不能完全进行确证；此外，采用反相色谱分离需用离子对试剂增加LHYP的保留性，因此色谱和质谱的兼容性较差，无法满足大量样品同时检测的需求。本研究采用亲水性相互作用色谱一四极杆串联线性离子阱质谱对含蛋白食品中的L—HYP进行定性与定量测定。亲水性相互作用色谱能够较好地分离多种氨基酸类，方法简便，无需衍生，灵敏度高，同时由于使用高比例的有机相，与质谱具有良好的兼容性，方法的灵敏度较高；

5、可以满足日常检测中大量试样同时检测的需求。2实验部分2．1仪器与试剂API4000O—TRAP四极杆串联线性离子阱质谱仪(美国AB公司)；SHISEDONanoSpace高效液相色谱仪(日本资生堂公司)；AllegraX-22R高速离心机(美国Beckman公司)；固相萃取装置(美国Suplco公司)。0．22um有机相滤膜(德国cNw公司)。HLB固相萃取小柱(200mg，3mL，美国Waters公司)。L一羟脯氨酸(L—Hydroxyproline)，L一茶氨酸(L—Theanine)，L一亮氨酸(L—Leucine)，L一异亮氨

6、酸(L—Is0一leucine)和L一精氨酸(L—Arginine)的标准品(纯度均大于99％，美国Sigma公司)。牛胰蛋白酶14043U／rag，猪胰蛋白酶14670U／mg(美国Sigma公司)；乙腈、甲醇(HPLC纯，J．T．Baker公司)；甲酸(ACS纯，201卜02-23收稿；201卜O5—27接受本文系上海市科委技术标准专项(No．09DZ0503700)、长三角科技合作项目(No．10595812100)和质检公益性行业专项(N0．20101007304)和国家质检总局课题(No．2009IK314，2011IK23

7、2)资助E—mail：deng~@shciq．gov．cn分析化学第39卷J．Baker公司)及甲酸铵(HPLC纯，德国CNW公司)，实验用水为超纯水(Millipore系统生产)。2．2标准储备液及标准工作溶液的配制分别称取0．0100g标准品，用纯水溶解，乙腈稀释并定容至10mL，配制成10g／L标准储备液。于4℃冰箱内避光保存，有效期为12个月。吸取适量标准工作溶液，用基质空白溶液配制成适当浓度的混合标准工作溶液，临用时现配。2．3样品前处理称取均质固态试样(奶油、饼干、奶糖、奶粉、奶酪、巧克力)lg，或者液态试样(液态奶、炼奶

8、、冰淇凌)2g(精确至0．01g)，置于50mL塑料离心管中，加入适量L一茶氨酸标准溶液，5mL100mmol／L甲酸铵缓冲盐溶液，50“L蛋白酶液，漩涡混合2min，50℃下酶解3h后，加入5mL乙腈，涡旋振荡2min