免疫磁分离结合胶体金免疫层析法快速检测大肠杆菌O157：H7.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第12期2013年12月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1812—1816DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．30494免疫磁分离结合胶体金免疫层析法快速检测大肠杆菌O157：117崔希熊齐荣熊勇华山珊赖卫华(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047)(中国检验检疫科学研究院食品安全研究所，北京100123)摘要以抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体偶联磁珠制得免疫磁珠；以胶体金标记的抗大肠杆

2、菌O157：H7单克隆抗体为标记抗体，抗大肠杆菌O157：H7多克隆抗体和驴抗鼠二抗分别作为检测线和质控线成分制备胶体金免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离和胶体金免疫层析法相结合应用于大肠杆菌O157：H7的现场快速检测中。结果表明：1mL7．6x10CFU／mL菌液经过免疫磁珠分离富集后，用胶体金免疫层析法检测可得到阳性结果。对于10CFU／g大肠杆菌O157：H7污染的食品样本，经过6h预增菌，免疫磁珠分离和胶体金试纸条检测72min即可检出。本方法的建立对于食品中有害物质的现场快速检测具有重要意义。关键词免

3、疫磁分离；胶体金；免疫层析；大肠杆菌O157：H71引言免疫磁珠是对具有超顺磁性的微粒表面进行化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能捕获特异性抗原的磁珠_1I2]。将免疫磁珠与待测溶液混合，如有相应抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，形成抗原一免疫磁珠复合物，并在适当的磁场条件下分离出来，达到富集目标抗原的目的。Sung等将免疫磁分离技术与快速比色法结合，用于牛奶中金黄色葡萄球菌的检测，检测灵敏度为1．5×10CFU／mL；Yoshitomi等将免疫磁分离技术结合实时定量聚合酶链式反应，用于检测芫荽中微量大肠

4、杆菌O157：H7，样品在预增菌5h后检出；Mendonca等将免疫磁分离技术结合光纤免疫传感器用于单增李斯特菌以及绵羊李斯特菌的检测，其检测灵敏度为3x10CFU／mL。胶体金免疫层析技术具有简便、快速等特点。自1981年Leuvering等首次将胶体金免疫层析法用于检测后，这项技术在多个领域得到广泛应用。Le等将胶体金免疫层析技术用于动物性食物中的环丙氨嗪和三聚氰胺的实时陕速检测，这两种物质的检测灵敏度分别是0．22和0．26g／L；Moon等将胶体金免疫层析技术用于黄曲霉毒素B1的分析，10min内可检

5、出，检测灵敏度为10g／L。大肠杆菌O157：H7是肠出血性大肠杆菌的一个主要血清型，最低10个活菌就可能感染致病J。Lj等用多重聚合酶链式反应方法结合纳米磁性颗粒标记技术检测大肠杆菌O157：H7等4种食源性致病菌，检测灵敏度为316CFU／mL。李智洋等用一种基于化学发光和磁性纳米颗粒的方法检测大肠杆菌O157：H7，其检测灵敏度为10CFU／mL，检测时间约为3h。这两种方法需要经过良好培训的操作人员、较昂贵的精密检测仪器以及严格的检测条件。本研究将免疫磁分离技术和胶体金免疫层析技术相结合，首先通过免疫

6、磁珠将目标菌特异地从复杂的培养基质及背景菌群中分离并富集，再加入到胶体金免疫层析试纸条上进行检测，可以去除食品基质和杂菌的干扰，将待检样品富集浓缩到更小体积，从而大大提高了检测灵敏度和准确度，具有简便、快速、经济等特点。图1为检测过程的示意图。免疫磁分离结合胶体金试纸条检测大肠杆菌0157：1-17的方法目前尚未见报道，本方法的建立对于大肠杆菌O157：H7在基层的筛查和防控具有重要意义。2013-05-22收稿；2013-08-08接受本文系国家自然科学基金(No．31271863)，南昌大学食品科学与技术

7、国家重点实验室自由探索课题(No．SKLF—ZZB~01307)，南昌市科技项目(No．2012．CYH．DW．SP-001)资助{E—mail：talktolaiwh@163．COin分析化学第41卷盐缓冲液-0．02％吐温20涤2遍，磁分离后吸出洗涤液，最后用1mL磷酸盐缓冲液重悬磁珠，将上清液、洗涤液、磁珠重悬液及对照组作合适倍数稀释，取100涂布于大肠杆菌O157：H7选择性培养基，平行制备3个样品。37cI=培养12～16h，选择菌落数在20—200范围内的进行计数，按公式(1)计算其捕获效率(CE

8、)：CE(％)=×10。(1)式中，c为对照组中菌落总数；C为上清液中菌落总数；C，为洗涤液中菌落总数。2．2．3在实际样本中的捕获效果称取25g(mL)市售牛肉馅或新鲜牛奶置于无菌的三角瓶内，添加培养好的大肠杆菌O157：H7模拟污染，至目标菌浓度约为10CFU／g(CFU／mL)，然后加入225mL改良EC肉汤，37℃，160r／min摇床培养8h，取1mL上层清液到离心管里，各添加0．05mg