免疫胶体金技术快速检测大肠杆菌o157和志贺毒素论文

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1、上海交通大学硕士学位论文免疫胶体金技术快速检测大肠杆菌O157和志贺毒素姓名：高成秀申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：严亚贤;孙建和20080101上海交大硕士论文免疫胶体金技术快速检测大肠杆菌O157和志贺毒素摘要摘要大肠杆菌O157是产志贺毒素大肠杆菌（Shiga-producingEscherichiacoli,STEC）的主要血清型，可以引起人和动物的腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜。志贺毒素（Shigatoxin，Stxs）是大肠杆菌O157的主要毒力因子之

2、一，有两个生物型：Stx1和Stx2，只产生Stx2的菌株毒力比只分泌Stx1和两者同时分泌的菌株毒力都强。Stx2致病剂量极低，且分泌胞外，Stx2的检测将直接有助于对分离菌株致病力强弱的判定，提高对高致病性大肠杆菌O157菌株的检出。因此本课题研究大肠杆菌O157和Stx2的胶体金层析法(Ｇｏｌｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａｓｓａｙ，　ＧＩＣＡ)，进行高致病性大肠杆菌O157菌株检测和鉴定，以便更好的预防和控制大肠杆菌O157所致的人和动物的疾病。将本实验室构建的重组Stx2B亚单位

3、的质粒pGEX-Stx2B转化入大肠杆菌BL21，然后采用PCR和酶切进行鉴定，将阳性转化菌进行重组蛋白的表达、鉴定、纯化，用纯化的融合蛋白多次免疫新西兰大白兔制备抗重组Stx2B的多克隆抗体。同时用大肠杆菌O157ATCC43889全菌体抗原多次免疫新西兰大白兔，制备抗大肠杆菌O157多克隆抗体。用硫酸胺法、辛酸-硫酸胺法、ProteinG亲和层析3种方法分别纯化制备的多克隆抗体，结果表明：ProteinG法纯化的抗重组Stx2BIgG纯度较其前两者纯，其金标多抗的稳定性较好，辛酸-硫酸胺法纯化的抗大肠

4、杆菌O157IgG的活性较ProteinG纯化的好，其金标多抗的稳定性较好，因此本试验采用ProteinG法纯化抗Stx2B血清，用辛酸-硫酸胺法纯化抗大肠杆菌O157血清。根据试纸条的侧向流动和胶体金的示踪功能，结合免疫学原理，分别建立并优化了检测大肠杆菌O157和Stx2的双抗体夹心免疫胶体金方法。测定了胶体金颗粒的最优化反应体系：胶体金颗粒的大小为20nm；抗体与胶体金溶液结合的最佳pH约为8.2；最佳蛋白结合量分别为抗大肠杆菌O157IgG为57µg/mL，抗重组Stx2BIgG为III上海交大硕

5、士论文摘要60µg/mL；最佳稳定剂为BSA；最佳缓冲液为pH8.2硼酸溶液；最佳金标保存液和洗涤液为5mMNaCl-1%BSA的pH8.2的硼酸缓冲液；NC膜的封闭液为3％BSA的0.01mol/LPBST；Stx2试纸条和大肠杆菌O157试纸条的质控线（C线）上的羊抗兔IgG的多克隆抗体最佳点样量均为1µg，其检测线（T线）的抗Stx2的单克隆抗体的点样量为0.1µg、抗大肠杆菌O157的单克隆抗体的点样量为1µg，结合垫上的金标抗大肠杆菌O157和重组Stx2B多克隆抗体点样量均为3µg。用已建立的

6、大肠杆菌O157免疫层析法对实验室保存的58株已鉴定的菌株进行检测，与血清凝集实验结果相比较，其阳性检出率的符合率达87.5%，检测下限为105CFU/mL，显色时间为3～5分钟，阳性检出率的批内平均变异系数为2.1%，阳性检出率的批间平均变异系数为6.9%。用已建立的Stx2免疫层析法对实验室保存的58株已鉴定的菌株进行检测，与Vero细胞毒性实验相比较，其阳性检出率的符合率为50%，显色时间为5～10分钟，阳性检出率的批内平均变异系数为2.6%，阳性检出率的批间平均变异系数为28.85%。大肠杆菌O1

7、57试纸条的特异性、重复性和敏感性较好，大肠杆菌O157免疫胶体金试纸条转化为商用试纸条是可行的。Stx2免疫胶体金试纸条在抗体效价、敏感性方面还需进一步优化，以提高阳性检出率和重复性。关键词：大肠杆菌O157；Stx2；免疫胶体金层析法；抗体纯化；反应体系；检测IV上海交大硕士论文ABSTRCTRAPIDGOLDIMMUNOCHROMATOGRAPHYASSAYSFORDETECTIONOFE.COLIO157ANDSHIGATOXINABSTRACTShiga-producingEscherichia

8、coli,especiallyserotypeO157,havebeenassociatedwithhemorrhagiccolitis,hemolyticuremicsyndrome(HUS),andthromboticthrombocytopenicpurpura.Stxs（Shigatoxin,Stxs）arethemajorpathogenicityfactorsofE.coliO157whichhavebeenimp