食品中产志贺毒素大肠杆菌的分离和快速鉴定.pdf

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5、附电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOFMS），建立高通量快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的研究方法。在本方法中，采用产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的标准菌株为代表对象进行方法研究。主要从四个方面进行项目研究，首先对目标菌株进行分离研究：采用免疫磁珠富集分离目标菌株，并验证磁珠的特异性及灵敏度。实际样品检测中，结合药物及显色培养基快速准确分离目标菌株。其次多重PCR-DHPLC检测方法的研究：以rfbE（O157）、wzx（O111）为目的基因，确立多重PCR-DHPLC反应条件及体系，验证该方法的特异性及

6、灵敏度，并与RT-PCR方法进行灵敏度比较，随机抽取270份食品样品进行检测。然后进行MALDI-TOFMS检测方法的研究：分析前期处理方法、培养基种类及培养时间对质谱图造成的影响，采用最佳的方法获取目标菌株的质谱图并添加数据库中。对目标菌株设置不同的培养条件后，验证该方法的准确性。最后解决基质对菌体活性干扰及降解难题，分析其均匀性及稳定性，并在全国范围内开展检测O111和O157的能力验证。在本次目标菌株富集分离研究中，结果表明免疫磁珠具有良好的特异性和灵敏度，可以应用于致病微生物的分离，提高检测效率。在多重PCR-DHPLC实验

7、中，表明多重PCR-DHPLC具有良好的特异性并与RT-PCR具有相同梯度的灵敏度，可以同时检测O111和O157，检测限达到25CFU/mL。在129份牛肉样品中，检出1例O111和3例O157；74份鸡肉样品中，检出O111和O157各1例；67份蔬菜样品中，并未检测到目标菌。MALDI-TOFMS检测方法中，使用TSB液体培养基培养24-36h获取目标菌株质谱图，添加数据库后，均鉴定为大肠杆菌。但是由于两种目标菌株质谱图相似，本次实验并没有完全准确鉴定两种目标菌株，需要结合分子及血清学达到精确鉴定的目的。能力验证样品研究中，绿

8、豆粉作为基质，具有良好的均匀性及稳定性。在全国138间实验室组织开展能力验证，检测正确率为98%。关键词：产志贺毒素大肠杆菌O111和O157，分离，多重PCR-DHPLC，MALDI-TOFMS，检测，能力验证IAbstractAb