禽病原性大肠杆菌E058株iucA、iucAiutA基因及sit与aerobactin操纵子基因突变株的构建及其生物学特性研究.pdf

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1、禽病原性大肠杆菌E058株iucA、iucAiutA基因及sit与aerobactin操纵子基因突变株的构建及其生物学特性研究ConstructionandcharacterizationofiucA，iucAiutA，sitandaerobactinoperonmutantsinavianpathogenicE．coliE058本文受国家自然科学基金(30972196、30771604、30471281)、国家863计划(2003AA222141)资助研究生：凌洁璐专业：微生物学导师：高崧教授刘秀梵教授扬州大学兽医学院2012年5月摘要——煳燃

2、

3、5广禽病原性大肠杆菌E058株iucA、

4、iucAiutA基因及sit与aerobactin操纵子基因突变株的构建及其生物学特性研究要研究生：凌洁璐导师：高崧教授刘秀梵教授禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichiacoli，APEC)弓I起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病，且易与其它病原性细菌、病毒并发或混合感染。目前，该病己成为危害养禽业的重要细菌病，给世界范围内养禽业造成了巨大的经济损失。病原性大肠杆菌天然形成了特定利用铁元素的摄取系统(specificironassimilationsystem)，这一系统由气杆菌素(aerobactin)的合成以及气杆菌素特定的外膜蛋白

5、受体(由iutA编码)两部分组成。Williams最早在大肠杆菌中发现了这一系统，细菌的这两种成分在铁含量很少的情况下，均能被强烈地诱导表达。Lafont等研究表明，气杆菌素合成的相关基因只存在于有毒力的菌株，在无毒力菌株中并没有发现。编码气杆菌素的5个基因，共处于一个操纵子，位于ColV这一大质粒上，其中参与气杆菌素合成的是iucA、iucB、iucC和iucD4个基因，而iutA编码一种膜蛋白受体。本研究旨在探讨编码气杆菌素的iucA、iuM基因以及aerobactin和sit操纵子与APEC致病性间的关系，了解APECiucA、iutA以及aerobactin和sit操纵子基因突变株

6、的生物学特性，为了解APEC的致病机理和特异性防治措施奠定基础。本研究运用同源重组的方法构建了E058AiucA、E058AiucAAiutA及E058Avir基因缺失突变株，其中vir包括sit及aerobactin操纵子的15kb大小的片段。同时将含iucA完整阅读框的质粒pGEX一6P．1．iucA电转化突变株E058AiucA，从而筛选获得回复株Re．E058AiucA。PCR扩增带酶切位点的iucA基因并插入到pBSK载体的多克隆位点中，然后运用分子克隆方法将Zeocin抗性基因插入到目的基因iucA中，构建出带Zeocin抗性摘要基因的质粒pS—iucA．Zeo。PCR扩增片段

7、iucA．Zeo，并电转化入带有质粒pKD46的禽病原性大肠杆菌分离株E058中，运用同源重组的方法，筛选出基因突变株E058AiucA，将片段iutA．Kan电转化入带有质粒pKD46的单突变株E058AiucA中，筛选出双突变株E058AiucAAiutA。以质粒pUC4K为模板，PCR扩增片段，电转化带有质粒pKD46的E058菌株中，运用同源重组的方法，筛选出基因突变株E058Avir。Southernblot结果表明Zeocin、Kanamycin抗性基因在APECE058突变株质粒中的插入是单拷贝的；RT-PCR结果表明iucA、iutA基因的缺失只影响其本身的表达，而未影响其

8、上下游基因的表达。Aerobactinproduction试验结果显示突变株E058AiucA、E058AiucAAiutA、E058Avir不能产生aerobactin，而野生株E058、回复株Re．E058AiucA都可以产生aerobactin。生长曲线的测定结果显示突变株E058AiucA、E058AiucAAiutA、E058Avir和亲本株E058在生长速度上没有显著差异；E058、E058AiucA、E058AiucAAiutA及E058Avir株的半数致死量(LD50)分别为104一、105一、104·8和105oCFU；鸡巨噬细胞HD一11吞噬试验结果表明突变株与亲本株的

9、侵袭能力没有显著差异；体外竞争结果显示，突变株较E058株轻度致弱；体内竞争实验表明，与野生株E058相比，突变株E058AiucA、E058AiucAAiutA毒力高度致弱；动态分布试验结果表明，突变株E058AiucA在心血中含菌量是12CFU．ml。(p