致断奶仔猪腹泻和猪水肿病大肠杆菌o141株及o8株基因突变株lpxllpxmlpxp的构建及其免疫效力研究

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1、闩振致断奶仔猪腹泻和猪水肿病人肠杆菌0141株及08株皋渊突变株LpxLpxMLpxP的构建及其免疫效力的研究1致断奶仔猪腹泻和猪水肿病大肠杆菌0141株及08株基因突变株LpxLLpxMLpxP的构建及其免疫效力研究摘要研究生：闰振导师：高崧教授刘秀梵教授断奶仔猪腹泻和猪水肿病是由产志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin．producingEscherichiacoli，STEC)弓l起的一种常见且重要的细菌性传染病，易与其它病原菌、病毒并发或继发感染，给世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失。引起断奶仔猪腹泻和猪水肿病的大肠杆菌国外报道的血清型主要有0139

2、、0138、0141、08、0157、045等。STEC是革兰氏阴性菌，其细胞壁中含有脂质双分子层。细胞壁的内膜主要由磷脂构成而外壁层主要由磷脂和脂多糖(1ipop01ysaccharide，LPS)构成。LPS由类脂A、核心多糖和O一特异性多糖三部分组成。类脂A中长脂肪链的紧密叠加以及LPS的疏水部共同形成了细菌的通透性屏障。类脂A在革兰氏阴性菌的致病性方面起重要作用。它可以激活体内的内在免疫系统，使阳离子抗菌肽、细胞因子、凝固因子以及其他免疫刺激因子的合成增多。类脂A包含四条(R)．3．hydroxyacy主链，其中某些(R)-3一hydroxyacy链可以

3、进一步乙酰化修饰。LpxL和LpxM在大肠杆菌类脂A分子生物合成的最后一步中起重要作用，这一步发生于细菌细胞壁的内壁层。在正常温度下，细菌在酰基合成转移酶的作用下将月桂酰和肉豆蔻酰连续不断地添加到四酰化产物中间体上。但是，在12℃低温环境时，酰基合成转移酶LpxP代替LpxL发挥作用，从而使链结合软脂酮。LpxL和LpxM基因的突变使细菌的致病力及对吞噬细胞的抵抗力均降低。本研究运用等位基因交换的方法构建LpxL的单基因突变株和LpxLLpxMS叹基因缺失突变株以及LpxLLpxMLpxP三重突变株。PCR扩增带有酶切位点的LpxL、LpxM和LpxP基因片段并

4、将其插入到pMDl8．Tsimple载体中相应酶切位点处，再运用分子克隆的方法将Cam抗性基因分别插入到目的基因LpxL、LpxM和LpxP中，构建出带Cam抗性基因标志的载体pT-LpxL—Cam、pT-LpxM-Cam和pT-LpxP—Cam。PCR扩增片段LpxL—Cam、LpxM-Cam和扬州人学顾’I：学位论文lMIIIIIllllllIlllIIIIiIIIIIllI，Y2258491——兰LpxP．Cam，并电转化入带有质粒pKD46的猪病原性大肠杆菌分离株014l和08中，在Red重组系统中质粒pKD46表达的重组酶的帮助下，筛选出0141及08

5、株的基因突变株0141M_,pxL△LpxMzkLpxP、08ALpxLZkLpxMALpxP，并在pCP20的作用下去除Cam抗性。Southernblot结果显示朋丁位点基因在STEC0141及08株的基因组中的插入是单拷贝的；RT-PCR结果表明突变株的LpxL、LpxM矛ILpxP基因不能转录，而其上下游基因的转录未受到影响。体外生长曲线的测定结果表明014ALpxLALpxMALpxP、08ALpxLALpxMALpxP突变株的生长速率与野生株相比明显减慢。本研究制备了基因缺失株的灭活菌，并对其在小鼠体内诱导体液免疫及其对强毒株攻击后的免疫保护力等方面

6、进行了研究，为PWD和ED基因工程疫苗的研制奠定了基础。将己构建的基因缺失株的菌株制成抗原，经灭活后制成油乳剂疫苗免疫小鼠，用f自J接ELSIA法定期检测小鼠血清和粪便中的抗体产生情况。抗体检测结果表明，突变株经灭活后免疫能够诱导小鼠产生针对上述三种保护性抗原的特异性抗体IgG。用大肠杆菌野生株0141和08攻毒后，对2种病原体的免疫保护力均达80％以上。关键词：产志贺毒素大肠杆菌；LpxLLpxMLpxP；突变株；免疫效力；11％111闩振敏断奶仔猪腹泻和猪水肿病人肠杆菌0141株及08株綦斟突变株LpxLpxMLpxP的构建及其免疫效力的研究3Constru

7、ctionofLpxLLpxMLpxPmutantsofshigatproduCgEscherichiacoli0⋯and08ringtoxln-Droduclng／Ssctlertchtacolt141ancauslnpost—weaningdiarrheaandedemadiseaseofpigsandevaluationottheirimmuneetticacv^●●一一AbstractM．S．candidate：YanZhenAdvisor：Prof．GaoSongProf．LiuXiufanPorcinepost--weaningdiarrheaand

8、edemadisease